MODULATION DES LEBERWACHSTUMS NACH PFORTADERLIGATUR MITTELS HEPATOTROPER WACHSTUMSFAKTOREN Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.) Annnika_methodik2.jpg RattenPVLprä Vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät RattenPVLpost der Friedrich-Schiller-Universität Jena von Annika Marissa Böhm geboren am 20.06.1988 in Düsseldorf sham120h pvl-120h sham PVL index-TUNEL-sham1-neu.jpg Gutachter 1. Prof. Dr. Utz Settmacher, Jena pvl-120h chol-120h 2. Prof. Dr. Dr. Stefan Schultze-Mosgau, Jena PVL Chol leber-pvl-effekte1 Kopie.jpg 3. PD Dr. Andreas Schnitzbauer, Frankfurt/Main pvl-120h egf-120h hgf-120h-2 epo120h PVL EGF HGF EPO Datum der Verteidigung: 04.03.2014 1 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ALAT Alanin-Aminotransferase AP alkalische Phosphatase ASAT Aspartat-Aminotransferase BrdU Bromodesoxyuridin CHOL Pfortaderligatur mit Cholestase-Gruppe DNA Desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure DNM Dimethylnitrosamine EGF Epidermal growth factor EPO Erythropoetin FGF Fibroblast growth factor FRLV Future remnant liver volume GLDH Glutamatdehydrogenase HGF Hepatocyte growth factor HVJ Hemagglutinating virus of Japan IL-6 Interleukin-6 PH Partielle Hepatektomie PVE Portal vein embolisation, Pfortaderembolisation PVL Portal vein ligation, Pfortaderligatur rhHGF Recombinant human hepatocyte growth factor ROI Regions of interest SHAM Kontroll-Gruppe Tab. Tabelle TELV Total estimated liver volume TGF-a Transforming growth factor-alpha TGF-ß Transforming growth factor-beta TNF-a Tumornekrosefaktor-a TUNEL Terminal desoxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin Nick End Labeling 2 Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... 3 2 Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................... 4 3 Zusammenfassung ............................................................................................................. 6 4 Einleitung ............................................................................................................................. 8 4.1 Leberregeneration im Allgemeinen .......................................................................... 8 4.2 Leberregeneration nach Resektion ......................................................................... 9 4.3 Bedeutung der Wachstumsfaktoren ...................................................................... 10 4.4 Leberresektion nach Pfortaderembolisation ......................................................... 11 5 Ziele der Arbeit .................................................................................................................. 12 6 Methodik ............................................................................................................................ 13 6.1 Studienpopulation ..................................................................................................... 13 6.2 Ablauf der Studie ...................................................................................................... 14 6.3 Untersuchungsmethoden ........................................................................................ 20 6.3.1 Gewichte ............................................................................................................ 20 6.3.2 Laborwerte ......................................................................................................... 20 6.3.3 Histologische Untersuchung ........................................................................... 21 6.4 Statistik ....................................................................................................................... 23 7 Ergebnisse ......................................................................................................................... 25 7. 1 Pfortaderligatur und Kontrolle ................................................................................. 25 7.1.1 Gewichte ............................................................................................................ 25 7.1.2 Laborwerte ......................................................................................................... 26 7.1.3 Histologie ........................................................................................................... 29 7.2 Pfortaderligatur mit und ohne Cholestase ............................................................ 33 7.2.1 Gewichte ............................................................................................................ 33 7.2.2 Laborwerte ......................................................................................................... 35 7.2.3 Histologie ........................................................................................................... 39 7.3 Pfortaderligatur mit und ohne Wachstumsfaktoren ............................................. 41 7.3.1 Gewichte ............................................................................................................ 41 7.3.2 Laborwerte ......................................................................................................... 44 7.3.3 Histologie ........................................................................................................... 48 8 Diskussion ......................................................................................................................... 53 8.1 Methodendiskussion ................................................................................................ 53 8.2 Pfortaderligatur und Kontrolle ................................................................................. 53 8.2.1 Gewicht .............................................................................................................. 54 8.2.2 Laborwerte ......................................................................................................... 56 8.2.3 Histologie ........................................................................................................... 56 8.3 Pfortaderligatur mit und ohne Cholestase ............................................................ 57 8.3.1 Gewicht .............................................................................................................. 57 8.3.2 Laborwerte ......................................................................................................... 59 8.3.3 Histologie ........................................................................................................... 61 8.4 Pfortaderligatur mit und ohne Wachstumsfaktoren ............................................. 62 8.4.1 Epidermal growth factor ................................................................................... 63 8.4.2 Erythropoetin ..................................................................................................... 64 8.4.3 Hepatocyte growth factor ................................................................................ 65 9 Schlussfolgerung .............................................................................................................. 69 10 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 71 11 Anhang ............................................................................................................................... 81 3 Zusammenfassung Die Pfortaderembolisation am Menschen ist eine etablierte therapeutische Maßnahme um bei Patienten mit zentralen Lebertumoren und der Notwendig-keit einer erweiterten Leberresektion das Risiko eines postoperativen Leberver-sagens zu verringern. Sie induziert in der nicht-embolisierten Leber einen Zu-wachs an funktionstüchtigem, gesundem Gewebe. Allerdings kommt es bei ei-nigen Patienten nur zu einer geringen postinterventionellen Zunahme des Le-bervolumens bzw. muss einigen Patienten ein langes Zeitintervall zwischen Embolisation und Operation einkalkuliert werden. Das Ziel dieser Studie war, den Effekt verschiedener stimulierender Faktoren auf die Leberhypertrophie nach einer Pfortaderligatur zu überprüfen. In unserer tierexperimentellen Studie an 71 männlichen Wistar-Ratten wurde überprüft, ob die hepatotropen Wachstumsfaktoren Epidermal growth factor (EGF), Hepatocyte growth factor (HGF) und Erythropoetin (EPO) die Leberge-neration nach einer Pfortaderligatur zusätzlich stimulieren. Dazu wurden die Tiere in sechs Gruppen eingeteilt: 1. Kontrollgruppe, 2. alleinige Pfortaderligatur (PVL= englisch „portal vein ligation“), 3. PVL und Ligatur des Hauptgallengan-ges, 4. PVL mit EGF, 5. PVL mit HGF und 6. PVL mit EPO. Nach einer Beo-bachtungszeit von 24 Stunden (n=36) und von 120 Stunden (n=35) wurden die Tiere getötet und die Leber entnommen. Das Gesamtlebergewicht sowie die Gewichte der ligierten und nicht-ligierten Lappen der Leber wurden bestimmt. Nach immunhistologischer Färbung der formalinfixierten Leber mit einem Proliferationsmarker (ki-67) und einem Apoptosemarker (TUNEL) wurde der Proliferations- bzw. Apoptoseindex be-rechnet. Die Blutproben wurden präoperativ, postoperativ sowie nach 120 Stunden entnommen und GLDH, ALAT, alkalische Phosphatase, direktes und gesamtes Bilirubin, Kreatinin, Gesamteiweiß und Harnstoff bestimmt. Zwischen der Kontroll- und der PVL-Gruppe zeigten sich eine signifikante Ge-wichtszunahme des nicht-ligierten Leberabschnittes sowie eine stark erhöhte Proliferation als Zeichen der Hypertrophie. Dieser Effekt war bei Leberschädi-gung durch Cholestase nicht verringert. Die zusätzliche portale Gabe von EGF oder EPO nach der Pfortaderligatur beeinflussten nicht die Gewichtszunahme oder Proliferation. Alleine HGF zeigte eine stimulierende Tendenz. Insgesamt konnte der Hypertrophie/Atrophie-Effekt auf die Leber nach experi-menteller Pfortaderligatur im Rattenmodell bestätigt werden. Die zusätzliche portale Injektion von HGF nach der Pfortaderligatur könnten das Wachstum des nicht-ligierten Leberabschnittes fördern. 4 Einleitung Die Inzidenz von Lebertumoren im Jahr 2012 betrug nach Angaben des Robert Koch-Instituts 7.500 Menschen pro Jahr in Deutschland. Zu den häufigsten Le-bertumoren gehören das hepatozelluläre Karzinom, sowie das cholangiozelluläre Karzinom und sind die zehnt häufigste Krebstodesursache in Deutschland (Robert Koch-Institut 2012). Zentrale Lebertumore können mit er-weiterten Leberresektionen kurativ therapiert werden. Da nach den ausgedehn-ten Operationen häufig nur ein geringer Leberanteil in situ bleibt, ist das Risiko für ein postoperatives Leberversagen erhöht (Rahbari et al. 2011). Um diesen Leberanteil zu vergrößern, wird in hepatobiliären Zentren häufig eine Pfortade-rembolisation der kranken Seite durchgeführt, die dann zu einer präoperativen Vergrößerung der gesunden Seite führt. Aber auch mit diesem Verfahren allein ist nicht immer eine ausreichende Vergrößerung zu erreichen, so dass in dieser Studie der Einfluss einer zusätzlichen Gabe von verschiedenen hepatotropen Wachstumsfaktoren untersucht wurde. 4.1 Leberregeneration im Allgemeinen Die Leber ist ein lebenswichtiges Organ, indem sie vitale Funktionen erfüllt wie die Metabolisierung von Kohlenhydraten, Fetten und Vitaminen, die Elimination von schädlichen Stoffwechselprodukten, sowie die Synthese von Proteinen wie Albumin, Akute-Phase-Proteine, Lipoproteine, Enzyme und Cofaktoren. Schwe-re Verletzungen der Leber, ausgedehnte Resektionen, entzündliche oder ma-ligne Lebererkrankungen sowie Intoxikationen, die diese Funktion massiv be-einträchtigen, gefährden den gesamten Organismus (Schmidt et al. 2005). Wenn eine partielle Entfernung der Leber beabsichtigt wird, muss für eine aus-reichende postoperative hepatische Funktion gesichert sein, dass mindestens 15-20 Prozent des Ausgangsvolumens erhalten bleibt. Diese restliche Leber reicht mit ihrer zunächst beschränkten Funktion zum Überleben aus. Aufgrund der zunehmenden Hypertrophie bzw. hervorragenden Regenerationsvermögen der Leber verbessert sich die hepatische Funktion mit jedem postoperativen Tag. Innerhalb von Monaten verbessert sich die Leberfunktion deutlich, weil die Leber wieder auf die normale Größe hypertrophiert. Bereits 1931 beschrieben Higgins und Anderson (Higgins und Anderson 1931) diese außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit, die sehr komplexen Regulationsmechanismen unter-liegt und noch nicht bis ins Detail geklärt ist. 4.2 Leberregeneration nach Resektion Die Leberregeneration nach einer partiellen Leberresektion ist ein komplexer Wirkmechanismus, der üblicherweise in drei Phasen eingeteilt wird: Die erste Phase über Cytokine, die zweite über Wachstumsfaktoren und die dritte über Metabolismus (Yokoyama et al. 2007). Die Cytokine wie Tumornekrosefaktor-a (TNF-a), die in den Kupffer-Zellen pro-duziert werden oder wie Interleukin-6, das in allen Leberzellen gebildet wird, induzieren bei den inaktiven Hepatozyten einen Wechsel in den Zellzyklus (G0/G1). Diese Vorbereitung der Hepatozyten wird Priming genannt und um-fasst die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NF-.B, AP-1, STAT3 und C/EBPß) sowie der Genexpression von c-jun, c-fos und c-myc (Rauchfuss et al. 2012, Yokoyama et al. 2007). Danach wirken Wachstumsfaktoren wie HGF (Hepatocyte growth factor) oder EGF (Epidermal growth factor), die die Zellen im Zellzyklus (G1/S) halten. Die-ser Effekt wird durch TNF-a, Östrogene, Norepinephrine, Prostaglandine und Insulin weiter gesteigert, ohne dass sie selbst eine mitogene Funktion ausüben (Yokoyama et al. 2007). Nach Durchlaufen der G2-Phase und der weiteren Initialisierung der Mitose der Hepatozyten beginnen die Proliferation der Leberstammzellen, Kupfferzellen, Gallenepithelzellen und der Endothelzellen sowie die Angioneogenese. Die Re-generation startet in der Peripherie der Leberlappen und folgt der physiologi-schen Migration der Zellen zum Zentrum. Neben den stimulierenden Faktoren sind auch inhibierende bekannt wie TGF-ß1, Activin (Matsumoto et al. 1992) und die Akute-Phase-Proteine (Kusashio et al. 2009). 4.3 Bedeutung der Wachstumsfaktoren Unter den Wachstumsfaktoren scheinen EGF und HGF am wichtigsten zu sein. EGF ist ein Protein, das bei der Einleitung der Mitose G1-S als Signalmolekül auftritt (Natarajan et al. 2007). Es wirkt auch als endokriner Faktor und wird in der Speicheldrüse gebildet (Fausto et al. 2006, Michalopoulos 2007). EGF-Rezeptoren befinden sich auf den Oberflächen der Hepatozyten. Sie werden nicht nur durch EGF, sondern auch durch TGF-a, Amphiregulin, Heparin-bindendes EGF, Betacellulin und Epiregulin aktiviert. Nach der Stimulation des EGF-Rezeptors wird über eine intrinsische Tyrosinkinase eine Signaltransduktionskaskade aktiviert, die die Zellproliferation steigert. Die wich-tigste Funktion des Rezeptors auf den Hepatozyten ist, die Stimulation der Pro-liferation zu gewährleisten und nicht das Überleben der Zellen (Natarajan et al. 2007). HGF ist ein multipotenter Wachstumsfaktor mit mitogenen, morphogenen, mo-togenen, angiogenen, antiapoptotischen (Matsumoto und Nakamura 1992) und antifibrogenen (Matsuda et al. 1995, Yasuda et al. 1996) Eigenschaften. HGF wird in den Nicht-Parenchymzellen und besonders in den Leberstammzellen gebildet. Der c-Met-Protoncogen-Rezeptor vom HGF (Bottaro et al. 1991, Naldini et al. 1991) befindet sich auf der Oberfläche der Hepatozyten. HGF be-einflusst nicht nur spezifisch die Leberzellen, sondern viele verschiedene Zell-typen (Matsumoto und Nakamura 1992). HGF ist der stärkste Stimulator der DNA-Synthese in den Hepatozyten (Matsumoto und Nakamura 1992, Rubin et al. 1993). Nach partieller Leberresektion ist HGF bis 20-fach erhöht und führt als stärkster hepatotroper Wachstumsfaktor zur Leberregeneration (Fujiwara et al. 1993). Erythropoetin (EPO) ist ein monomeres Glykoprotein, das in erster Linie in den peritubulären, interstitiellen Zellen der Niere (Fisher et al. 1996, Jacobson et al. 1957, Koury et al. 1991, Kuratowska et al. 1961) und zu einem geringeren Teil in den Hepatozyten (Koury et al. 1991, Zanjani et al. 1977) gebildet wird. EPO übt auf die Leber eine antiapoptotische sowie zytoprotektive Wirkung aus und kann die Entzündungsreaktion reduzieren (Le Minh et al. 2007). 4.4 Leberresektion nach Pfortaderembolisation Bei zentralen Lebertumoren ist eine erweiterte Resektion erforderlich, welche mit einer hohen perioperativen Morbiditätsrate von 68 Prozent und einer Morta-litätsrate von 10 Prozent einhergehen (van Gulik et al. 2011). Ein zu großer Le-berparenchymverlust kann vom Menschen nicht kompensiert werden. Ein Aus-weg ist präoperative Konditionierung mittels Pfortaderembolisation (PVE), wel-che durch die Steigerung des funktionellen Leberrestvolumens zu einer Verrin-gerung des postoperativen Risikos einer Leberdysfunktion führt. Soll also die rechte Leber entfernt werden und ist der linke Rest sehr klein, dann wird opera-tiv oder interventionell die rechte Pfortader verschlossen. Die hämodynamischen Veränderungen führen zur Freisetzung von Wachstumsfak-toren, die eine Hypertrophie des nicht-ligierten Leberanteils bewirkt (Uemura et al. 2000). Durch diese Pfortaderligatur schrumpft die rechte Seite und die linke Seite vergrößert sich gleichzeitig. Die Hypertrophie der linken Seite erhöht dann eine ausreichende postoperative Leberfunktion, wenn dann die rechte Seite entfernt wurde. Als orientierende Größe gilt heute, dass man eine ausreichende hepatische Funktion bei einem Leberrestvolumen von mindestens 20 Prozent unterstellt, wobei diese Angaben aber nur für eine gesunde Leber gelten. Nach einer Chemoembolisation benötigt man 30 Prozent und bei einer Leber mit einer ver-ringerten Leberfunktion reichen wahrscheinlich erst 40 Prozent aus (Abdalla et al. 2001). Um die Hypertrophie des „gesunden“ Leberlappens nach einem Pfortaderverschluss zu maximieren, wird nach Möglichkeiten gesucht, die kon-sekutive Hypertrophie der Leber zu erhöhen und zu beschleunigen. 5 Ziele der Arbeit Eine Modulation des Leberwachstums wäre wünschenswert, da es zu einer un-befriedigenden Hypertrophie nach PVE kommen kann. In der vorliegenden Stu-die wurde ein tierexperimenteller Ansatz unter Verwendung von hepatotroper Wachstumsfaktoren gewählt. Als Methode wurde die Pfortaderligatur gewählt. Zusätzlich wurde bei einer Gruppe eine Cholestase durch die Ligatur des Hauptgallengangs als Negativkontrolle provoziert. Das Ziel dieser Studie war, den Effekt verschiedener stimulierender Faktoren auf die Leberhypertrophie nach einer Pfortaderligatur zu überprüfen. Es wurde unterstellt, dass die Hyper-trophie des nicht-embolisierten Leberlappens durch Substanzen mit einem proli-ferativen Effekt beschleunigt werden könnte. Diese Vermutung wurde überprüft, indem direkt nach der experimentellen Pfortaderligatur Epidermal growth factor (EGF), Hepatocyte growth factor (HGF) oder Erythropoetin (EPO) in die Pfort-ader appliziert wurden. Sollten diese proliferativen Substanzen die Hypertrophie beschleunigen oder positiv beeinflussen, dann könnte ihr Effekt in Folgeexperi-menten mit Tumoren gerechtfertigt sein. 6 Methodik 6.1 Studienpopulation In dieser Studie wurde ein prospektives Rattenmodell nach Genehmigung durch das Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz ausgewählt. Insgesamt wur-den 71 männliche Wistar-Ratten eingeschlossen. Das Gesamtgewicht der Tiere schwankte zwischen 300 bis 580 g. Die Ratten wurden in sechs Hauptgruppen eingeteilt: Gruppe 1 Sham-Gruppe (n=12). In dieser Kontrollgruppe wurde nur eine Laparotomie mit nachfolgender Mobilisation der Leber durch die Durchtrennung des Ligamentum falciforme vorgenommen. Gruppe 2 PVL-Gruppe (n=12). In dieser Gruppe wurde nach Laparotomie eine Ligatur der Pfortader vorgenommen. Gruppe 3 Cholestase-Gruppe (n=12). In dieser Gruppe wurde nach Laparotomie eine Ligatur der Pfortader und eine Ligatur des Hauptgallenganges vorgenommen. Gruppe 4 EGF-Gruppe (n=11). In dieser Gruppe wurde nach Laparotomie eine Ligatur der Pfortader vorgenommen und zusätzlich EGF appliziert. Gruppe 5 HGF-Gruppe (n=12). In dieser Gruppe wurde nach Laparotomie eine Ligatur der Pfortader vorgenommen und zusätzlich HGF appliziert. Gruppe 6 EPO-Gruppe (n=12). In dieser Gruppe wurde nach Laparotomie eine Ligatur der Pfortader vorgenommen und zusätzlich EPO appliziert. Diese Hauptgruppen wurden in Abhängigkeit von der Nachbeobachtungszeit in zwei weitere Untergruppen eingeteilt. Die Nachbeobachtungszeit betrug entwe-der 24 Stunden oder 120 Stunden. Danach wurden die Tiere relaparotomiert. Ein Tier ist während der Intervention im Experiment verstorben, so dass nur 5 Tiere in die EGF Gruppe nach 120 Stunden eingeschlossen werden konnten. Tab. 1: Verteilung der 71 Ratten in die sechs Gruppen in Abhängigkeit von der Nachbeobachtungszeit Gruppen Abkürzung Nach 24 Std. Nach 120 Std. Kontrolle Sham n=6 n=6 Pfortaderligatur PVL n=6 n=6 Pfortaderligatur mit Cholestase CHOL n=6 n=6 Epidermal growth factor EGF n=6 n=5 Hepatocyt growth factor HGF n=6 n=6 Erythropoetin EPO n=6 n=6 Gesamtzahl n=36 n=35 6.2 Ablauf der Studie Die Studie wurde im Institut für Tierversuchskunde der Universität Jena durch-geführt. Das Tierexperiment erfüllte alle Auflagen des Tierschutzgesetzes. Alle Ratten wurden artgerecht gehalten und mit Wasser und Pelletstandardfutter versorgt. Nach mindestens sieben Tagen zur Eingewöhnung im Institut wurden die Operationen an den Ratten durchgeführt. Alle Tiere wurden zweimal narkotisiert und operiert. Die 2. Operation fand bei der Hälfte jeder Tier-Gruppe nach 24 und bei der anderen Hälfte jeder Gruppe nach 120 Stunden statt (Abb. 1). Abb. 1: Studiendesign Die Tiere wurden durch Inhalation von 1,25 – 2,0 Prozent Isofluran bei einer Sauerstoffdurchflussrate von 1,5 l/min betäubt. Das Isofluran-Narkosegerät war ein Vaporizer von der Firma Medizintechnik Leipzig, Medimorphsystem. Vor der 1. Operation wurde das präoperative Gewicht in Gramm gemessen und danach eine Identifikationsmarkierung durchgeführt. Danach wurde Blut aus dem retrobulbären Venenplexus entnommen und mit einer dünnen Glaslanzette in ein Eppendorf-Gefäß getropft. Unter Narkose wurde die Ratte im Operations-gebiet vom Xiphoid bis zum Schambein rasiert, mit Povidon-Iod (Betaisodona® Lösung, Mundipharma GmbH, Limburg) desinfiziert und mit den Vorder- und Hinterpfoten an der Operations-Platte fixiert. Während der ersten Narkose wur-de unter strikten sterilen Kautelen gearbeitet. Die Tiefe der Narkose wurde durch Schmerzreize überprüft, bevor die Haut in der Mittellinie vom Xiphoid bis zum Nabel inzidiert wurde. Danach wurde die Faszie durchtrennt und die Bauchhöhle eröffnet. Unter Sicht wurden die Anatomie der Rattenleber vorsichtig exploriert sowie die Verzweigung der Pfortaderäste und die Lage zum Gallengang identifiziert. Die Leber der Ratte besteht aus vier Lappen. Der linke Lappen befindet sich dorso-kaudal zum medianen und kranio-ventral zum kaudalen Lappen sowie zum Magen. Der mediane Lappen wird durch eine tiefe Fissur in zwei Teile ge-trennt. Er befindet sich unter dem Diaphragma und ist mit dem Ligamentum falciforme verbunden. Dieser Lappen umschließt fast die gesamte Gefäßwand der Vena cava. Der rechte Leberlappen ist dorsal mit dem Ligamentum hepatodiaphragma verbunden. Der rechte Lappen berührt sowohl das Dia-phragma als auch die Vena cava. Der kaudale Leberlappen befindet sich auf der linken Seite der V. cava und unterhalb des linken Lappens. Der erste Ast der Pfortader ist die rechte Portalvene, die in den gleichnamigen Lappen fließt. Der zweite Ast ist die kaudale Portalvene und fließt von links in den gleichnamigen Lappen. Die Hauptbifurkation teilt sich in die rechte, media-ne Portalvene und in die linke Portalvene. Die rechts-mediane Pfortader fließt in den rechts-medianen Lappen. Die linke Portalvene zweigt sich sofort auf und fließt als links-medianer Ast und als linker Ast in die gleichnamigen Leberlap-pen. Die A. hepatica folgt dem Astverlauf der Pfortader in der Leber. Die Vv. hepaticae unterteilen sich in die linke, links-mediane, die mittlere-mediane, rechts-mediane, die rechte, sowie die kaudale Vene. Der Gallengang mündet 2 cm hinter dem Pylorus in das Duodenum (Abb. 2). Abb. 2: Pfortaderaufteilung (schematisch), Zeichung von Herrn Jens Geiling, Institut für Anatomie, FSU Jena In der Sham-Gruppe wurde nur das Lig. falciforme oberhalb der Leber durch-trennt und das Abdomen wieder verschlossen. Bei allen anderen Gruppen wur-de der gemeinsame Pfortaderast aufgesucht, der den linken und medianen Le-berlappen versorgt, die geeignete Stelle am Pfortaderast freipräpariert und mit einem 6-0 Polyglaktinfaden (Vicryl®, Ethicon, Norderstedt) ligiert. Die Ligatur erfolgte unter Verwendung eines Stereomikroskops (Zeiss OPMI 1-FR, Deutschland), um versehentliche Unterbindungen von Ästen der Gallengänge bzw. von Ästen der A. hepatica zu vermeiden. Somit wurde eine Ligatur er-reicht, die die Leber in einen nicht-ligierten Teil mit ungefähr 30 Prozent und einen ligierten Teil mit der linken und medianen Leber von 70 Prozent trennt (Abb. 3). Abb. 3: Pfortaderligatur der medianen und linkslateralen Pfortaderäste (schematisch), Zeichung von Herrn Jens Geiling, Institut für Anatomie, FSU Jena In einer Gruppe (Cholestase) wurde der Gallengang zusätzlich am Hauptstamm oberhalb der Mündung des Pankreasganges ligiert. In den Wachstumsfaktoren-Gruppen wurde kein Gallengang ligiert und nach der Pfortaderligatur die 3 jeweiligen Wachstumsfaktoren in die Pfortader unterhalb der Ligatur appliziert. Die Menge des Wachstumsfaktors wurde in Abhängigkeit vom Körpergewicht der Ratte bestimmt. Nach der Ligatur wurden entweder 100 µg/kg Epidermal growth factor (Mitchell et al. 2005) oder 200 µg/kg Hepatocyte growth factor (Hasuike et al. 2005) oder 10 µg/kg Erythropoetinderivat Darbepoetin alfa (Aranesp®) (Le Minh et al. 2007) in die Portalvene injiziert. Der Situs wurde auf Blutungen kontrolliert. Bei allen 35 Tieren, bei denen eine portalvenöse Applikation durchgeführt wurde, wurde zusätzlich ein 1x1 cm²-Stück resorbierbarer Gelatineschwamm (Gelaspon®, Chauvin Ankerpharm, Berlin) zur Blutstillung eingelegt. Danach wurden alle Tiere zweischichtig mit fortlaufender Fasziennaht und mit Einzelknopfnähten der Haut verschlossen. Als Nahtmaterial wurde nichtresorbierbares Nylon (Ethilon®, Ethicon, Norders-tedt) der Stärke 3-0 verwendet. Der Ratte wurde danach erneut Blut in oben beschriebener Art und Weise abgenommen. Zum Schutz wurde ein Aluminium-Verband-Spray auf die Wunde gesprüht und das Tier in einen separaten Käfig gelegt, um aus der Narkose aufzuwachen. Es hatte freien Zugang zu Wasser und Nahrung. Das Blut wurde zwischenzeitlich zentrifugiert, das Serum abpipettiert, beschriftet und in einem -20°C Kühlschrank eingefroren. Die Relaparotomie wurde unter semisterilen Kautelen entweder nach 24 oder 120 Stunden vorgenommen. Das Tier wurde durch Inhalation von Isofluran be-täubt und danach gewogen. Eine dritte Blutprobe wurde aus dem retrobulbären Venenplexus entnommen. Die Ratte wurde am Operationsplatz mit Klebepflas-terstreifen unter maximaler Narkose fixiert und das Abdomen durch die zum Teil verheilte Narbe wiedereröffnet. Nach sorgfältiger und vorsichtiger Exploration der Bauchhöhle wurde die Leber stumpf vom umgebenden Gewebe abgelöst. Mit jeweils einer Klemme wurden die Vena cava superior, Vena cava inferior und die Strukturen des Leberhilus unterbunden. Mit einer Feingewebsschere wurden die Gefäße unterhalb der Klemme durchtrennt und die Leber stumpf von ihren letzten Verklebungen bzw. Bändern durchtrennt und entnommen. Das Tier wurde danach unter tiefster Betäubung durch eine Mitarbeiterin des Insti-tuts für Tierversuche der Universität Jena eingeschläfert. Die Ratten werden nach den Regeln des Instituts für Versuchstierkunde der Universität Jena ent-sorgt. Das Feuchtgewicht der Leber wurde gemessen. Von der Leber wurden die li-gierten Teile entfernt und das Lebergewicht erneut gemessen. In vorher vorbe-reiteten, beschrifteten Cryotubes wurden 0,5 x 0,5 cm² große, zufällig ausge-suchte Abschnitte von der ligierten bzw. nicht-ligierten Leber asserviert. Ein Teil wurde sofort nativ in flüssigem Stickstoff schockgefroren. In den 1,8 ml Volu-men fassenden Cryotubes befanden sich entweder 5%ige Formaldehydlösung, 2,5%ige Glutaraldehyd oder RNAlater (RNA stabilization reagent) von der Firma Ambion (Austin, Texas). Das Gewebe im Glutaraldehyd wurde bei Raumtempe-ratur aufrecht stehend aufbewahrt. Das Gewebe im RNAlater wurde nach halb-tägigem Einwirken bei Raumtemperatur gelagert. Die Gefäße mit Formaldehyd wurden im Kühlschrank aufbewahrt und die Gefäße mit RNAlater bei -20°C ein- gefroren. Das native Gewebe wurde im -80°C kalten Gefrierschrank aufbe-wahrt. 6.3 Untersuchungsmethoden 6.3.1 Gewichte In der Studie wurde das Gewicht der Tiere, der gesamten Leber und des ligier-ten Anteils der Leber gemessen. Das Körpergewicht der Tiere wurde in Narko-se direkt vor der Intervention und nach 24 bzw. 120 Stunden vor der Leberent-nahme in Gramm gewogen. Bevor das Lebergewicht in Gramm gemessen werden konnte, wurde eine Plas-tikschale auf eine Präzisionswaage gelegt und tariert. Nachdem die Leber ex-plantiert worden war, wurde sie vollständig auf die Plastikschale gelegt und mit der Präzisionswaage gewogen. Anschließend wurde die Leber inspiziert und die nicht-ligierten und ligierten Teile identifiziert. Die Leber wurde entlang des makroskopisch sichtbaren ligierten Anteils geteilt und der ligierte Teil gewogen. Durch Subtraktion des ligierten Gewichtes vom Lebergesamtgewicht konnte das nicht-ligierte Lebergewicht berechnet werden. Da sich die Körpergewichte und damit auch die Lebergewichte zwischen den Gruppen deutlich unterschieden, wurden die relativen Gewichte des ligierten und nicht-ligierten Anteils in Prozent berechnet. Zusätzlich wurde das Gesamt-lebergewicht zum Körpergewicht in Beziehung gesetzt. 6.3.2 Laborwerte Die Blutproben aller Ratten wurden nach Zentrifugation bei 3,000 rpm für 10 min und nach Abpipettieren der Serums bei -20 Grad Celsius eingefroren und im Institut für klinische Chemie des Universitätsklinikums Jena analysiert. Fol-gende Blutwerte wurden bestimmt: ALAT, GLDH, direktes und gesamtes Biliru- bin, alkalische Phophatase, Gesamteiweiß, Kreatinin und Harnstoff. Es wurden nur die Blutwerte nach 120 Stunden und ohne die HGF-Gruppe aufgrund von versehentlicher Fehllagerung ausgewertet. 6.3.3 Histologische Untersuchung Aus den ligierten und nicht-ligierten Leberabschnitten wurden repräsentative Gewebeproben entnommen und in Formalin asserviert. Das Gewebe wurde in Paraffin eingebettet und mit einem Schlittenmikrotom in 1-2 µm dünne Schnitte geteilt. Dieses Material wurde immunhistochemisch auf das ki-67-Antigen un-tersucht sowie einer TUNEL-Analyse zugeführt. Begonnen wurde mit dem Nachweis auf das ki-67-Antigen. Das ki-67-Antigen ist ein Protein des Zellkerns (Gerdes et al. 1984) und findet sich nur in den akti-ven Phasen des Zellzyklus. Bei der G0-Phase und bei DNA-Reparaturmechanismen kommt das Protein nicht vor, weshalb es sich als Mar-ker für die aktive Proliferation eignet (Key et al. 1994, McCormick et al. 1993). Hierfür wurde das Gewebe auf einem Objektträger aufgetragen und mithilfe von Xylol und Alkohol entparaffiniert. Bei der ki-67-Methode wurde als nächstes die Antigendemaskierung durch 10-minütiges Kochen im Dampfdrucktopf in einem EDTA-Puffer pH 9,0 durchgeführt. Nachdem die Antigenstruktur freigelegt wor-den war, erfolgte die Immunfärbung mit den ki-67-Antikörpern mit der Labelled (Strept)Avidin-Biotin-Methode, bei der die Affinität von Avidin zu Biotin genutzt wurde. Im letzten Schritt wurde mit Haematoxylin, Xylol und Alkohol zur Kern-darstellung gefärbt. Nach dem Eindecken mit einem Deckglas war das Präparat fertig zum Mikroskopieren. Zu Beginn wurden die ki-67-Färbungen unter einer Leica DM LB-Mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) betrachtet, wobei einige aufgrund niedriger Schnitt- oder Färbequalität aussortiert wurden. Von jedem verbliebenen Schnitt wurden zehn „Regions of interest“ (ROI) bei einer 200fachen Vergrößerung standardisiert fotografiert. Fünf Fotos bildeten die Zentralvene und das umliegende Leberparenchym ab und die anderen fünf das Portalfeld mit der Glisson Trias. Als Erkennungs- und Auswertungsprogramm wurde „Analysis auto“ der Firma Olympus verwendet. Zur Auszählung der ingesamt 1200 Bilder diente ein Macro des Programms „Analysis auto“, das speziell für diese Fragestellung entwickelt wurde und das anhand von Größe, Form und Farbe der Hepatozytenkerne die Gesamtzahl der Hepatozyten und die Zahl der ki-67-positiven Hepatozyten bestimmte. Vorab wurde eine Validierung des Macros durchgeführt. Aus jeweils zehn ROI pro Schnitt wurde der Proliferationsindex (dem Quotienten aus den ki-67-positiven, proliferierenden Hepatozyten zur Gesamthepatozytenzahl) berechnet. Alle Schnitte wurden histologisch auch nach der TUNEL-Methode untersucht, bei der die Zellkerne apoptotischer Zellen unter dem Lichtmikroskop nachweis-bar waren. TUNEL ist die Abkürzung von Terminal desoxynucleotidyl transfera-se mediated dUTP-biotin Nick End Labeling. Bei der Apoptose fragmentieren Endonukleasen den DNA-Strang des Zellkerns. An den Bruchenden werden Hydroxygruppen frei und können in situ durch das Enzym Terminal- Desoxynucleotidyltransferase mit markierten Nukleotiden versehen werden, die dann als Marker für Apoptose dienen (Gavrieli et al. 1992). Für die Analyse wurde das Kit „In Situ Cell Death Detection Kit, POD“ der Firma Roche (Mannheim, Deutschland) verwendet. Auch hier startete der Prozess mit einer Xylol-Reihe und einer absteigenden Alkoholreihe des auf einen Objektträ-ger aufgetragenen Gewebes, bei der es entparaffiniert und rehydriert wurde. Im Anschluss folgte eine zusätzliche gewebeabhängige Behandlung zur Permeabilisierung und anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen mit H2O2 blockiert. Im weiteren Verlauf wurde nach Herstellerprotokoll die TUNEL-Reaktionslösung, Converter-POD und Substratlösung hinzugefügt. Nach dem Eindecken mit einem Deckglas war das Präparat fertig zur mikroskopischen Untersuchung. Zu Beginn wurden die TUNEL-Färbungen unter einer Leica DM LB-Mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) betrachtet, wobei einige aufgrund niedriger Schnitt- oder Färbequalität aussortiert wurden. Von jedem verbliebenen Schnitt wurden zehn „Regions of Interest“ (ROI) bei einer 200fachen Vergrößerung standardisiert fotografiert. Fünf Fotos bildeten die Zentralvene und das umliegende Leberparenchym ab und die anderen fünf das Portalfeld mit der Glisson Trias. Als Erkennungs- und Auswertungsprogramm wurde „Analysis auto“ der Firma Olympus verwendet. Bei dem Apoptosemarker TUNEL wurden die Gewebe der Tiere mit einer Nachbeobachtungszeit von 120 Stunden ausgewertet. Zuerst wurden wie oben beschrieben zehn ROIs pro Schnitt fotografiert (560 Fotos). Danach wurden alle Fotos händisch mit Hilfe des „Analysis auto“ Programms der Firma Olympus ausgezählt und ausgewertet. Aus jeweils zehn ROI pro Schnitt wurde der Apoptoseindex (dem Quotienten aus den TUNEL-positiven Hepatozyten zur Gesamthepatozytenzahl) berechnet. Da die Hepatozyten den Hauptanteil des Lebervolumens ausmachen, ist für die makroskopische Atrophie des Leberlap-pens der Hepatozytenzelltod ausschlaggebend (Greengard et al. 1972). Die Schnitte und Färbungen wurden im Institut für Pathologie der Universität Bochum (Leitung: Frau Professor Dr. med. A. Tannapfel) hergestellt. Die mikro-skopische Analyse wurde durch uns am Institut für experimentelle Transplanationschirurgie unter der Leitung von Frau Professor Dr. med. U. Dahmen an der Universitätsklinik Jena durchgeführt. 6.4 Statistik Die Studie wurde in drei Teilen ausgewertet. Im ersten Teil wurde die Sham-Gruppe mit der PVL-Gruppe verglichen, um den Effekt der Pfortaderligatur ge-genüber der Kontrollgruppe zu überprüfen. Im zweiten Teil wurde die PVL-Gruppe mit der Cholestase-Gruppe verglichen, um den Effekt der Kombination aus Pfortaderligatur und Ligatur des Hauptgallengangs zu untersuchen. Im drit-ten Teil wurden die Gruppen PVL, EGF, HGF und EPO miteinander verglichen, um den Einfluss der Wachstumsfaktoren zu bestimmen. In jedem einzelnen Teil wurden eine Nullhypothese (H0) und eine alternative Hypothese (HA) aufgestellt und gegeneinander überprüft. Die Nullhypothese lautete: H0: Es gibt keinen Unterschied zwischen den Gruppen. Die alternative Hypothese lautete: HA: Es gibt einen Unterschied zwischen den Gruppen. Als Hauptzielkriterium galt das postinterventionelle Wachstum der nicht-ligierten Leber. Es wurde das Gewicht des nicht-ligierten Leberlappen gemessen und in Beziehung zum gesamten Lebergewicht gesetzt. Das relative Lebergewicht in Prozent wurde zwischen den Gruppen in einem zweiseitigen Signifikanztest verglichen. Als Signifikanzniveau wurde a=0,05 festgelegt. Als weitere Neben-zielkriterien der Studie galten leberspezifische Blutwerte sowie die histologische Auszählung von Proliferations- und Tumormarkern der Leber. Alle Daten wurden in eine Excel-Tabelle eingegeben. Die Daten wurden in SPSS Ver. 19 (Chicago, Illinois, USA) eingelesen und ausgewertet. Die Ergeb-nisse der deskriptiven Analyse numerischer Werte werden als Median und Be-reich angegeben. Die Werte der einzelnen Gruppe wurden als Box-and-Whisker-Plots mit einer 5%-95%-Perzentile dargestellt. Kategorische Werte wurden in Häufigkeiten angegeben. In jedem einzelnen Teil wurden die numerischen Werte zwischen den Gruppen mit nichtparametrischen Mann-Whitney-Tests (zwei Gruppen) oder Kruskal-Wallis-Tests (vier Gruppen) verglichen. Kategoriale Parameter wurden mit dem Fisher’s exakt Test vorgenommen. Als Signifikanzniveau galt immer a=0,05. Es wurde keine Anpassung des Signifikanzniveaus durch die Mehrfachtestung vorgenommen. 7 Ergebnisse In die Auswertung der Studie wurden 71 Tiere aufgenommen. Das Ausgangs-gewicht aller Tiere (n=71) betrug 374 g (287-580 g). 7. 1 Pfortaderligatur und Kontrolle 7.1.1 Gewichte Im ersten Teil wurde die Sham-Gruppe mit der PVL-Gruppe nach 24 und 120 Stunden verglichen (Mann-Whitney-Test). Zwischen den beiden Gruppen be-stand ein Unterschied (p<0,05) bereits im Körpergewicht, so dass die absoluten Werte nicht aussagekräftig waren. Deshalb wurden die Relativgewichte vergli-chen. Abb. 4 : Vergleich des Quotienten aus dem nicht-ligierten Lebergewicht und dem Lebergesamtgewicht zwischen der Kontrolle und der Pfortaderligatur nach 24 und 120 Stunden Das Verhältnis des nicht-ligierten Lebergewicht zum Lebergesamtgewicht in Prozent ist in Abbildung 4 dargestellt. In der Sham-Gruppe wurden die ligaturkorrespondierenden Leberlappen als nicht-ligiertes Lebergewicht ver-wendet. Es zeigte sich sowohl nach 24 Stunden (p=0,004) als auch nach 120 Stunden ein Unterschied (p=0,004). Dasselbe trifft auch auf den Anteil der ligierten Leber am Lebergesamtgewicht in Prozent zu. Sowohl nach 24 Stunden (p=0,004) als auch nach 120 Stunden (p=0,004) waren die Werte deutlich unterschiedlich. Der Quotient aus dem Lebergewicht zum Körpergewicht (Abb. 5) war nach 24 Stunden (p=0,5) und nach 120 Stunden (p=1,0) nicht verschieden. Abb. 5: Vergleich des Quotienten aus dem Lebergesamtgewicht und dem Körper-gewicht zwischen der Kontrolle und der Pfortaderligatur nach 24 und 120 Stunden 7.1.2 Laborwerte Die Laborwerte wurden in allen drei Blutproben präoperativ, direkt postoperativ und postoperativ nach 120 Stunden gemessen. Gesamteiweiß, Kreatinin und Harnstoff wurden bestimmt und ergaben weder Veränderungen zu den ver-schiedenen Zeitpunkten (p>0,3) noch zwischen den beiden zu betrachtenden Gruppen (p>0,3) (Tab. 3-5 im Anhang). Die alkalische Phosphatase war in beiden Gruppen nur nach 120 Stunden ver-schieden (p=0,01) und unterschied sich nicht im Verlauf (p=0,25) (Abb. 6). Abb. 6: Vergleich der alkalischen Phosphatase zwischen der Kontrolle und der Pfortaderligatur zu verschiedenen Zeitpunkten Postoperativ erhöhten sich die ALAT–Werte in beiden Gruppen (p=0,02), wobei die Werte in der PVL höher stiegen (p=0,025). In der Kontrolle sank der Wert innerhalb von 120 Stunden wieder auf präoperative Werte, während die Werte in der PVL weiter erhöht blieben (Abb. 7). Das direkte (Tab. 2 im Anhang) und gesamte Bilirubin (Abb. 8) war lediglich direkt postoperativ in der PVL erhöht (p=0,01). Abb. 7: Vergleich der ALAT-Werte zwischen der Kontrolle und der Pfortaderligatur zu verschiedenen Zeitpunkten Abb. 8: Vergleich des gesamten Bilirubins zwischen der Kontrolle und der Pforta-derligatur zu verschiedenen Zeitpunkten Die GLDH stieg nur nach 120 Stunden in der PVL (p=0,1) (Abb. 9). Abb.9: Vergleich der GLDH-Werte zwischen der Kontrolle und der Pfortaderligatur zu verschiedenen Zeitpunkten 7.1.3 Histologie Der ki-67-Index stieg in der PVL sehr stark an (Abb. 10). Selbst die ligierten Ab-schnitte der PVL zeigten einen höheren ki-67-Index (p<0,001) als die Kontrolle. Der Index war nach 24 und 120 Stunden vergleichbar (p>0,5) (Abb. 11). Abb. 10: Beispielhafte Fotos der ki-67-Färbungen vom nicht-ligierten Leberab-schnitt und ligierten Leberabschnitt nach 120 Stunden von der Kontrolle und der Pfortaderligatur. Bei der ki-67-Färbung zeigen sich die inaktiven Hepatozytenkerne in Blautönen, wobei Zellkerne in Proliferation violettrot erscheinen. Nicht-ligierte Leberabschnitte Ligierte Leberabschnitte Kontrolle PVL Abb. 11: Vergleich der ki-67-Indices zwischen der Pfortaderligatur und der Kontrolle im ligierten und nicht-ligierten Leberlappen nach 24 und 120 Stunden In der Kontrolle und im nicht-ligierten Abschnitt der PVL besteht kein Unter-schied in der Apoptose (p=0,8) (Abb. 12). In den ligierten Abschnitten der PVL ist sie dagegen im Vergleich hoch (p<0,001) (Abb. 13). Abb. 12: Beispielhafte Fotos der TUNEL-Färbungen vom nicht-ligierten Leberab-schnitt und vom ligierten Leberabschnitt nach 120 Stunden von der Kontrolle und der Pfortaderligatur. Bei der TUNEL-Färbung zeigen sich die inaktiven Hepatozytenkerne in Grautönen, wobei Zellkerne in Apoptose dunkelbraun erschei-nen. Nicht-ligierte Leberabschnitte Ligierte Leberabschnitte Kontrolle PVL Abb. 13: Vergleich der TUNEL-Indices zwischen der Pfortaderligatur und der Kon-trolle im ligierten und nicht-ligierten Leberlappen nach 120 Stunden 7.2 Pfortaderligatur mit und ohne Cholestase 7.2.1 Gewichte Im zweiten Teil wurde die Pfortaderligatur (PVL) mit der Pfortaderligatur in Kombination mit der Cholestase (Cholestase) nach 24 und 120 Stunden vergli-chen. Zwischen den beiden Gruppen bestand ebenfalls ein Unterschied (p<0,05) im Körpergewicht, so dass die absoluten Werte nicht aussagekräftig waren. Deshalb wurden die Relativgewichte verglichen. Das Verhältnis des nicht-ligierten Lebergewicht zum Lebergesamtgewicht in Prozent (Abb. 14) zeigte nach 24 Stunden (p=1,0) und auch nach 120 Stunden (p=0,63) keinen Unterschied zwischen den Gruppen. Nach 120 Stunden hatte das nicht-ligierte Lebergewicht in der PVL (p=0,004) und auch in der mit Cholestase (p=0,004) zugenommen. Abb.14: Vergleich des Quotienten aus dem nicht-ligierten Lebergewicht und dem Lebergesamtgewicht zwischen der Pfortaderligatur und der Cholestase nach 24 und 120 Stunden Auch der Anteil der ligierten Leber am Lebergesamtgewicht in Prozent war beim Vergleich beider Gruppen sowohl nach 24 Stunden (p=1,00) als auch nach 120 Stunden (p=0,63) nicht verschieden. Der Quotient aus dem Lebergewicht zum Körpergewicht (Abb. 15) war nach 24 Stunden (p=0,52) nicht verschieden, jedoch fiel zwischen den Gruppen nach 120 Stunden (p=0,13) ein geringer Unterschied auf. Abb.15: Vergleich des Quotienten aus dem Lebergesamtgewicht und dem Körper-gewicht zwischen der Pfortaderligatur und der Cholestase nach 24 und 120 Stun-den 7.2.2 Laborwerte Die Laborwerte wurden in allen drei Blutproben präoperativ, direkt postoperativ und postoperativ nach 120 Stunden gemessen. Gesamteiweiß, Kreatinin und Harnstoff wurden bestimmt und ergaben weder Veränderungen zu den ver-schiedenen Zeitpunkten (p>0,3) noch zwischen den beiden zu betrachtenden Gruppen (p>0,3) (s. Tab. 3-5 im Anhang). Zwischen PVL und Cholestase zeigte die alkalische Phosphatase keinen Unter-schied prä- und postoperativ (p >0,3), jedoch nach 120 Stunden war sie in der Cholestase angestiegen (Abb. 16). Abb.16: Vergleich der alkalischen Phosphatase zwischen der Pfortaderligatur und der Cholestase zu verschiedenen Zeitpunkten Die ALAT–Werte stiegen postoperativ in beiden Gruppen an (p=0,001) (Abb. 17), wobei die Werte in der Cholestase noch höher waren (p=0,095). Abb.17: Vergleich der ALAT-Werte zwischen der Pfortaderligatur und der Choles-tase zu verschiedenen Zeitpunkten Sowohl das direkte (Tab. 2 im Anhang) als auch das gesamte Bilirubin (Abb. 18) stiegen postoperativ (p<0,002). In der Cholestase-Gruppe war das direkte (p=0,08) und das gesamte Bilirubin (p=0,28) höher als in der PVL. Die GLDH stieg postoperativ an (p=0,001). Ein Unterschied zwischen beiden Gruppen war nicht nachweisbar (p=0,2) (Abb. 19). Abb. 18: Vergleich des gesamten Bilirubins zwischen der Pfortaderligatur und der Cholestase zu verschiedenen Zeitpunkten Abb. 19: Vergleich der GLDH-Werte zwischen der Pfortaderligatur und der Choles-tase zu verschiedenen Zeitpunkten 7.2.3 Histologie Der ki-67-Index war nach 120 Stunden höher als nach 24 Stunden (p=0,003) (Abb. 20). In den nicht-ligierten Abschnitten war der Index in der Pfortaderligatur deutlich höher (p=0,001), aber nach 120 Stunden war die Cholestase wiederum höher (p<0,001). In den ligierten Abschnitten unterschieden sich PVL und Cho-lestase nicht (p=0,48) und auch im zeitlichen Verlauf war der Index vergleichbar (p=0,13) (Tab. 6). Abb. 20: Beispielhafte Fotos der ki-67-Färbungen vom nicht-ligierten Leberabschnitt und vom ligierten Leberabschnitt nach 120 Stunden von PVL und PVL mit Cholesta-se. Bei der ki-67-Färbung zeigen sich die inaktiven Hepatozytenkerne in Blautönen, wobei Zellkerne in Proliferation violettrot erscheinen. Nicht-ligierte Leberabschnitte Ligierte Leberabschnitte PVL PVL mit Cholestase Tab. 6: ki-67-Indices im ligierten und nicht-ligierten Leberlappen im Median (Range) bei der Pfortaderligatur und der Cholestase nach 24 und 120 Stunden ki-67 positive Hepatozyten im nicht-ligierten Leberlappen [%] ki-67 positive Hepatozyten im ligierten Leberlappen [%] 24 STUNDEN PVL 13,2 (0,9-63,6) 0,9 (0,0-5,4) Cholestase 4,7 (0,0-21,2) 0,8 (0,0-5,1) 120 STUNDEN PVL 9,8 (0,0-25,5) 1,1 (0,0-10,6) Cholestase 34,9 (0,6-63,7) 3,7 (0,4-10,8) Die Apoptoserate unterschied sich nicht zwischen den Gruppen (p=0,6) (Abb. 21). Lediglich in den ligierten Abschnitten war sie in der PVL etwas höher (p=0,06). In den nicht-ligierten Abschnitten war die Apoptose zwischen den Gruppen vergleichbar (p=0,28) (Tab. 7). Tab. 7: TUNEL-Indices im ligierten und nicht-ligierten Leberlappen im Median (Range) bei der Pfortaderligatur und der Cholstase nach 120 Stunden TUNEL positive Hepatozyten im nicht-ligierten Leberlappen [%] TUNEL positive Hepatozyten im ligierten Leberlappen [%] 120 STUNDEN PVL 0,0 (0,0-2,4) 1,0 (0,0-5,2) Cholestase 0,0 (0,0-1,2) 0,6 (0,0-2,7) Abb. 21: Beispielhafte Fotos der TUNEL-Färbungen vom nicht-ligierten Leberabschnitt und vom ligierten Leberabschnitt nach 120 Stunden von PVL und PVL mit Cholestase. Bei der TUNEL-Färbung zeigen sich die inaktiven Hepatozytenkerne in Grautönen, wobei Zellkerne in Apoptose dunkelbraun erscheinen. Nicht-ligierte Leberabschnitte Ligierte Leberabschnitte PVL PVL mit Cholestase 7.3 Pfortaderligatur mit und ohne Wachstumsfaktoren 7.3.1 Gewichte Im dritten Teil wurde die einfache Pfortaderligatur (PVL) mit der Pfortaderligatur mit jeweils drei verschiedenen Wachstumsfaktoren (EGF, HGF und EPO) nach 24 und 120 Stunden verglichen (Kruskal-Wallis-Test). Zwischen den vier Grup- pen bestand bereits im Körpergewicht ein Unterschied (p<0,05), so dass die absoluten Werte nicht aussagekräftig waren. Deshalb wurden die Relativge-wichte verglichen (Tab. 8). Tab. 8: Lebergewichte im Median (Range) bei der Pfortaderligatur, HGF, EGF und EPO nach 24 Stunden und 120 Stunden Lebergesamt-gewicht (g) nicht-ligiertes Lebergewicht (g) ligiertes Lebergewicht (g) Nicht-ligiertes Lebergewicht : Lebergesamtgewicht (%) 24 STUNDEN PVL 14,4 (11,2-18,0) 5,0 (4,1-6,0) 9,0 (6,3-13,7) 36,6 (23,9-43,8) HGF 10,0 (9,2-13,7) 4,6 (4,2-4,9) 5,5 (4,8-8,9) 45,4 (35,1-48,2) EGF 14,8 (9,3-18,2) 6,4 (2,5-7,5) 8,1 (6,7-11,3) 39,4 (27,4-49,4) EPO 10,8 (9,1-13,3) 4,8 (3,5-7,2) 5,5 (4,0-9,1) 49,9 (31,7-61,4) 120 STUNDEN PVL 10,0 (8,4-14,1) 6,0 (4,5-7,7) 4,1 (2,7-6,5) 54,9 (47,1-73,9) HGF 11,6 (9,0-16,8) 7,7 (6-9,3) 3,2 (3,0-8,8) 68,3 (47,6-74,7) EGF 10,9 (10,7-16,8) 7,6 (4,7-9,2) 5,5 (3,3-8,7) 62,5 (43,0-69,5) EPO 11,4 (8,6-21,5) 7,2 (4,0-10,8) 4,9 (2,5-10,7) 58,3 (47,3-73,7) Beim Verhältnis des nicht-ligierten Lebergewichtes zum Lebergesamtgewicht in Prozent (Abb. 22) zeigte sich innerhalb der Gruppen nach 24 Stunden (p=0,11) und auch nach 120 Stunden (p=0,45) kein Unterschied. Allerdings nahm das Gewicht nach 120 Stunden zu (p<0,001). Beim direkten Vergleich von HGF mit PVL zeigte sich ein Unterschied nach 24 Stunden (p=0,03), jedoch nicht mehr nach 120 Stunden (p=0,3). Abb. 22: Vergleich des Quotienten aus dem nicht-ligierten Lebergewicht und dem Lebergesamtgewicht zwischen der Pfortaderligatur, HGF, EGF und EPO nach 24 und 120 Stunden Auch der Anteil der ligierten Leber am Lebergesamtgewicht in Prozent zeigte beim Vergleich der vier Gruppen sowohl nach 24 Stunden (p=0,113) als auch nach 120 Stunden (p=0,45) keinen Unterschied. Nach 120 Stunden war das Gewicht niedriger als nach 24 Stunden (p<0,001). Der Quotient aus dem Lebergewicht zum Körpergewicht (Abb. 23) war inner-halb der Gruppen nach 24 Stunden (p=0,058) und nach 120 Stunden (p=0,79) nicht verschieden. Abb. 23: Vergleich des Quotienten aus dem Lebergesamtgewicht und dem Körper-gewicht zwischen der Pfortaderligatur, HGF, EGF und EPO nach 24 und 120 Stun-den 7.3.2 Laborwerte Die Laborwerte wurden auch hier in allen drei Blutproben präoperativ, postope-rativ und nach 120 Stunden gemessen. Gesamteiweiß, Kreatinin und Harnstoff waren weder zu den verschiedenen Zeitpunkten (p>0,3) noch zwischen den Gruppen (p>0,3) unterschiedlich (Tab. 3-5 im Anhang). Die alkalische Phosphatase war im Verlauf (p=0,1) nicht unterschiedlich. Zwi-schen den Gruppen war eine geringe Schwankung messbar (p=0,009) (Abb. 24). Abb. 24: Vergleich der alkalischen Phosphatase zwischen der Pfortaderligatur, EGF und EPO zu verschiedenen Zeitpunkten Die ALAT-Werte (Abb. 25) stiegen postoperativ in allen Gruppen an und sanken innerhalb von 120 Stunden (p<0,001). Zwischen den Gruppen waren die Werte vergleichbar (p=0,3). Abb. 25: Vergleich der ALAT-Werte zwischen der Pfortaderligatur, EGF und EPO zu verschiedenen Zeitpunkten Das direkte (Tab. 2 im Anhang) und gesamte Bilirubin (Abb. 26) stiegen im Ver-lauf an (p<0,001). Zwischen den Gruppen unterschieden sich die Werte nicht (p>0,08). Die GLDH war zwischen den Gruppen nicht verschieden (p=0,65). Allerdings stieg die GLDH im Verlauf in allen Gruppen an (p<0,001) (Abb. 27). Abb. 26: Vergleich des gesamten Bilirubins zwischen der Pfortaderligatur, EGF und EPO zu verschiedenen Zeitpunkten Abb. 27: Vergleich der GLDH-Werte zwischen der Pfortaderligatur, EGF und EPO zu verschiedenen Zeitpunkten 7.3.3 Histologie Insgesamt unterschied sich der ki-67-Index nicht zwischen den Gruppen (p=0,24) und auch nicht im Zeitverlauf (p=0,14) (Abb. 28). Im nicht-ligierten An-teil unterschied sich der ki-67-Index (p=0,003) auch zwischen den Gruppen. Die EGF-Gruppe hatte den niedrigsten Index. Der Index nahm nach 120 Stunden deutlich ab (p<0,001). Die ligierten Abschnitte unterschieden sich zwischen den Gruppen (p=0,04), aber nicht im Zeitverlauf (p=0,8) (Tab. 9). Tab. 9: ki-67-Indices im ligierten und nicht-ligierten Leberlappen im Median (Range) bei der Pfortaderligatur, HGF, EGF und EPO nach 24 und 120 Stunden ki-67 positive Hepatozyten im nicht-ligierten Leberlappen [%] ki-67 positive Hepatozyten im ligierten Leberlappen [%] 24 STUNDEN PVL 13,2 (0,9-63,6) 0,9 (0,0-5,4) HGF 12,4 (1,2-63,9) 1,0 (0,0-3,2) EGF 6,1 (0,0-3,9) 1,3 (0,0-8,6) EPO 13,5 (0,6-27,9) 0,0 (0,0-4,4) 120 STUNDEN PVL 9,8 (0,0-25,5) 1,06 (0,0-10,6) HGF 7,9 (1,59-38,8) 0,69 (0,0-5,2) EGF 12,7 (0,0-34,6) 0,0 (0,0-2,3) EPO 5,6 (1,3-37,7) 0,9 (0,0-6,2) Abb. 28: Beispielhafte Fotos der ki-67-Färbungen vom nicht-ligierten Leberab-schnitt nach 120 Stunden von PVL mit und ohne Wachstumsfaktoren. Bei der ki-67-Färbung zeigen sich die inaktiven Hepatozytenkerne in Blautönen, wobei Zellkerne in Proliferation violettrot erscheinen. Nicht-ligierte Leberabschnitte Ligierte Leberabschnitte PVL EGF HGF EPO Die Apoptose unterschied sich nur marginal zwischen den Gruppen (p=0,07) (Abb. 29). In den ligierten Abschnitten war sie in der PVL-Gruppe nied-riger (p=0,002). In den nicht-ligierten Abschnitten war die Apoptose nicht ver-schieden (p=0,99) (Tab. 10). Abb. 29: Beispielhafte Fotos der TUNEL-Färbungen vom ligierten Leberabschnitt nach 120 Stunden von PVL mit und ohne Wachstumsfaktoren. Bei der TUNEL-Färbung zeigen sich die inaktiven Hepatozytenkerne in Grautönen, wobei Zellkerne in Apoptose dunkelbraun erscheinen. Nicht-ligierte Leberabschnitte Ligierte Leberabschnitte PVL EGF HGF EPO Tab. 10: TUNEL-Indices im ligierten und nicht-ligierten Leberlappen im Median (Range) bei der Pfortaderligatur, HGF, EGF und EPO nach 120 Stunden TUNEL positive Hepatozyten im nicht-ligierten Leberlappen [%] TUNEL positive Hepatozyten im ligierten Leberlappen [%] 120 STUNDEN PVL 0,0 (0,0-2,4) 1,0 (0,0-5,2) HGF 0,0 (0,0-3,5) 1,7 (0,0-5,5) EGF 0,0 (0,0-0,5) 1,6 (0,0-9,5) EPO 0,0 (0,0-0,7) 1,9 (0,0-33,6) 8 Diskussion 8.1 Methodendiskussion Die Effektivität der Pfortaderembolisation und der Pfortaderligatur wurden in der Literatur miteinander verglichen. Nach Pfortaderembolisation war die FLRV sig-nifikant größer als nach der Ligatur (van den Esschert et al. 2011). Dieser Un-terschied wird von den Autoren durch die Embolisation der portalvenösen Peri-pherie begründet. Dabei soll der portalvenöse Links-Rechts-Shunt vermieden werden, der zu verringertem Regenerationsreiz mit konsekutiv geringerer Hy-pertrophie führt. Furrer et al. beschrieben dagegen eine höhere Zunahme der FLRV nach der Ligatur. Sie führten diesen Unterschied auf das verwendete Ma-terial zurück, das eine ausgeprägte Fremdkörperreaktion hervorruft (Furrer et al. 2008). In der embolisierten Leber stieg die Zahl der Makrophagen an, die wiederum in der nicht-embolisierten Leber zur Auslösung der Leberregeneration benötigt wird. Aufgrund der gelappten Leberanatomie spielt der Links-Rechts-Shunt bei der Ratte keine wesentliche Rolle. Die Pfortaderligatur bei der Ratte wurde ausge-wählt, um den Hypertrophie-Atrophie-Effekt zu induzieren, weil sie ein verlässli-ches Tiermodell mit geringerem technischen und logistischen Aufwand ist. Die Wahl der Wachstumsfaktoren erfolgte nach den schon beschriebenen hepatotropen Eigenschaften und wurde bisher noch nicht gemeinsam in einem Pfortaderligaturmodell verglichen. Als Negativkontrolle wurde die zusätzliche Induktion einer akuten Cholestase gewählt. Sie soll den Effekt einer Pfortaderli-gatur bei geschädigter Leber zeigen. 8.2 Pfortaderligatur und Kontrolle Rous und Larimore beschrieben nach Untersuchungen beim Kaninchen, dass der ligierte Leberlappen atrophiert und der nicht-ligierte an Größe zunimmt (Rous und Larimore 1920). Ozawa et al. belegten dann erstmals den Einfluss der Pfortaderligatur auf den mitochondrialen Stoffwechsel der Leber bei Ratten (Ozawa et al. 1971). Nachdem im Tierexperiment von Kraus und Beltran (Kraus und Beltran 1959) eine Tumorregression nach Ligatur der Pfortaderastes nach-weisbar war, der den Tumor versorgte, wurde die Pfortaderligatur erstmals von Honjo et al. an 20 Patienten mit Lebermalignomen klinisch eingesetzt (Honjo et al. 1975). Die Überlebenszeit betrug bei einem Patienten sogar sechs Jahre. Kinoshita et al. kombinierten die transarterielle Embolisation des Tumors mit einer Pfortaderembolisation bei 21 Patienten (50-72 Jahre), die an einem klei-nen hepatozellulärem Karzinom litten (Kinoshita et al. 1986). Beim Vergleich der Auswertungen von prä- und postinterventionellen Lebervolumina bestätigte sich eine Volumenzunahme der unbehandelten Leber. Makuuchi et al. entdeck-ten, dass bei einer vorher bestehenden Thrombose der Pfortader und nachfol-genden Leberresektion der betroffenen Seite, der nicht betroffene Leberanteil eine bessere Funktion aufwies (Makuuchi et al. 1990). Daraus entwickelte sich die Idee, die Pfortader vor einer geplanten Leberresektion gezielt auf der betrof-fenen Seite zu unterbinden oder zu embolisieren. Die kompensatorische Hyper-trophie der Restleber wurde damit eine anerkannte Methode, die seitdem im klinischen Alltag sehr erfolgreich eingesetzt wird. 8.2.1 Gewicht In unserer Studie atrophierten die ligierten Leberlappen nach der 70%igen Pfor-taderligatur und kompensatorisch hypertrophierten die nicht-ligierten Abschnitte. Unsere Ergebnisse sind sehr gut vereinbar mit denen anderer Arbeitsgruppen. Sugimoto et al. untersuchten zum Beispiel männliche Sprague-Dawley-Ratten, unterzogen sie einer 70%igen Pfortaderligatur mit Ligatur der lateralen und me-dianen Leberlappen und beobachteten die Tiere sieben und vierzehn Tage (n=36) (Sugimoto et al. 2009). Das relative nicht-ligierte Lebergewicht stieg von 9,3 ± 0,97 Prozent vor Pfortaderligatur auf 23,7 ± 1,7 Prozent nach sieben Ta-gen und auf 26,7 ± 2,7 Prozent nach 14 Tagen. Tanaka et al. verglichen bei Wistar-Ratten (200-230 g) die Pfortaderembolisation, die Pfortaderembolisation mit nachfolgender 70%iger Hepatektomie und alleiniger 70%iger Hepatektomie (Tanaka et al. 1994). Der nicht-ligierte Anteil war bei der alleinigen Pfortade-rembolisation nach sieben Tagen doppelt so groß wie in der Kontrollgruppe und bestand aus Dreiviertel der Gesamtlebermasse. Steiner und Martinez ligierten die Pfortader der linken und medianen Lappen (Steiner und Martinez 1961). Das nicht-ligierte Lebergewicht wuchs ab dem zweiten Tag stark bis zum vier-ten Tag, danach nahm die Wachstumsgeschwindigkeit ab. Der ligierte Anteil verlor dagegen 85 Prozent des Lebergewichtes im Vergleich zur Kontrolle. Nach dem siebten Tag veränderte sich das Gewicht nur noch sehr wenig. Bei Lee et al. begann der nicht-ligierte Anteil bereits am ersten Tag nach PVL zu wachsen und stieg auf das Dreifache bis zum siebten Tag (Lee et al. 1993). Zwischen dem siebten und 14. Tag fand sich ein Plateau ohne weiteres er-kennbares Wachstum. Kollmar et al. beschrieben in seinem Modell, dass das nicht-ligierte Lebergewicht am siebten Tag am höchsten war (Kollmar et al. 2007). Zusammenfassend vermag eine Unterbindung des portalvenösen Blut-flusses durch portalvenöse Ligatur die Leberregeneration des nicht-betroffenen Leberteils anzuregen (Goto et al. 1998). Zwischen der Kontrolle und der PVL zeigte sich bei allen Studien eine signifi-kante Gewichtszunahme des nicht-ligierten Leberabschnittes. In der Klinik wird der sogenannten future liver remnant volume (FLRV) berechnet. Es ist das Vo-lumen des vermeintlich übrig bleibenden Lebergewebes nach der Resektion. Das FLRV wird relativ zu dem abgeschätzten Lebergesamtgewicht (total estimated liver volume = TELV) nach folgender Formel berechnet: FLRV/TELV = FLRV/(Gesamtlebergewebe - Tumorgewebe) Bei zu geringem relativen FLRV kann die Pfortaderligatur bzw. Embolisation die Situation verbessern, weil bereits zwei bis acht Wochen später das relative Vo-lumen um 20-46 Prozent zugenommen hat. Durch die Vorbehandlung können dann 70-100 Prozent der Patienten einer großen Leberresektion zugeführt wer-den (Kaneko et al. 2002). 8.2.2 Laborwerte Nach der Pfortaderligatur stiegen die Leberwerte (ALAT) als Zeichen für den verursachten Leberschaden postoperativ und bleiben auch nach fünf Tagen noch leicht erhöht (ALAT, GLDH). Die Cholestaseparameter (Bilirubin und alka-lische Phosphatase) blieben weitgehend normal. Gesamteiweiß, Harnstoff und Kreatinin veränderten sich nicht. Die Funktion der Niere wurde nicht beeinträch-tigt. Zu vergleichbaren Ergebnissen kamen auch andere Arbeitsgruppen (Di Stefano et al. 2005, Hayashi et al. 2010, Matela et al. 2005). Die Transaminasen stiegen nach PVL innerhalb der ersten drei Tage bis zu ihrem Maximum und sanken zwischen dem siebten bis zehnten Tag wieder auf den präoperativen Wert. Die synthetische Funktion der Leber verändert sich dagegen nicht nach der PVL, obgleich das gesamte Bilirubin gering anstieg (Mizuno et al. 1996). 8.2.3 Histologie In unserer Studie zeigte sich eine erhebliche Proliferation der Hepatozyten im nicht-ligierten Leberanteil nach der Pfortaderligatur. Der ki-67-Index war deut-lich erhöht. Im ligierten Leberanteil fanden wir dagegen eine geringe Apoptose und Atrophie nach der PVL. Zu ähnlichen Ergebnissen gelangten De Graaf et al., die bei 20 weiblichen New Zealand-Hasen 80 Prozent der Leber embolisier-ten (de Graaf et al. 2010). Auch sie beschrieben eine massive Proliferation der Hepatozyten (ki-67) im nicht-ligierten Anteil. Furrer et al. teilten 80 männliche Wistar-Ratten, in vier Gruppen ein, die sie jeweils zu vier verschiedenen Zeit-punkten (24, 48, 72 Std und 7 Tage) untersuchten (Furrer et al. 2008). Sie führ-ten bei den Tieren entweder eine 70%ige Hepatektomie, eine 70%ige Pforta-derligatur, eine 70%ige Pfortaderembolisation oder eine Sham-Operation durch. Die Hepatektomie ließ die Leber am schnellsten regenerieren und zeigte auch die höchste Anzahl an ki-67-positiven Zellen, wobei der Effekt der Pfortaderliga-tur kaum zurückstand. Nach der Pfortaderembolisation regeneriert sich die Le-ber zeitlich langsamer und es ließen sich auch weniger proliferierende Zellen finden. Beim apoptotischen Zelltod können drei verschiedene Aktivierungskaskaden unterschieden werden: 1.) die rezeptorvermittelte Aktivierung über Caspase 3, 2.) die mitochondrienvermittelte Aktivierung über die Ausschüttung von Cytochrom C bei Dysfunktionen und 3.) die endoplasmavermittelte Aktivierung über die Stress getriggerte Caspase 12. Die gemeinsame Endstrecke über die Aktivierung von Caspase 9 führt dann zum Zelltod. Bei der Pfortaderligatur wird nach der Arbeitsgruppe von Picard et al. die mitochondriale Kaskade aktiviert (Picard et al. 2004). Die Gründe für den Zelltod sind eine Hypoxie sowie ein Mangel an portalen Leberwachstumsfaktoren. Die Atrophie ist durch die zentrolobuläre Nekrose und durch den apoptotischen Zelltod bedingt (Mueller et al. 2003). Lambotte et al. teilten männliche Wistar-Ratten (200-260 g) in vier Gruppen ein: 1.) Pfortaderligatur des rechten Hauptstammes, 2.) eine Resekti-on von Zweidritteln der Leber, 3.) eine Resektion von einem Drittel der Leber und 4.) eine Kontrollgruppe mit Sham-Operation (Lambotte et al. 2000). Nach 24 Stunden wurden nach der Pfortaderligatur nur 5 Prozent Nekrosen und nur wenige apoptotische Zellen beschrieben. Nach 48 Stunden stiegen die Nekro-sen auf bis zu 20 Prozent des Lebergewebes an und die Zahl der Apoptosen nahm zu. 8.3 Pfortaderligatur mit und ohne Cholestase 8.3.1 Gewicht In unserer Studie unterschieden sich die Gewichte nicht zwischen der einfachen Pfortaderligatur und der Pfortaderligatur mit gleichzeitiger Unterbindung des Hauptgallengangs, die zur Cholestase führte. In beiden Gruppen hypertrophier-te der nicht-ligierte Anteil und atrophierte der ligierte Anteil, wobei beide Effekte nach 120 Stunden ausgeprägter waren als nach 24 Stunden. Es fiel zusätzlich auf, dass das relative Lebergewicht in Bezug auf das Körpergewicht bei der Pfortaderligatur mit Cholestase etwas anstieg. Dies könnte sich durch den Ent-zündungsprozess in der cholestatischen Leber sowie dem Rückstau der Gallen-flüssigkeit erklären. Zu ähnlichen Ergebnisse gelangten auch andere Autoren. Mizuno et al. unter-suchten männliche Donryu-Ratten (Mizuno et al. 1996). Im ersten Experiment wurde eine 70%ige Pfortaderligatur mit einer Shamoperation verglichen. Im zweiten Experiment wurde eine Hauptgallengangsligatur nach dem Modell von Weinbren (Weinbren 1953) sowie mit Modifikationen von Terasaki et al. (Terasaki et al. 1991) vorgenommen und nach fünf Tagen entweder mit einer Pfortaderligatur oder Sham-Operation kombiniert. Das nicht-ligierte Leberge-wicht betrug ungefähr 30 Prozent nach der Pfortaderligatur mit und ohne cho-lestatischer Schädigung. Die Pfortaderligatur mit Gallengangsligatur hemmte zum fünften Tag das Wachstum auf 65 Prozent im Vergleich zu 75 Prozent nach alleiniger Pfortaderligatur. Schweizer et al. untersuchten 80 männliche Wistar-Ratten und teilten sie in vier verschiedenen Gruppen ein: 1.) 70%ige Choledochusligatur, 2.) 70%ige Pforta-derligatur; 3.) 70%ige Pfortader- und Choledochusligatur; 4.) Sham-Operation (Schweizer et al. 1995). Das Gesamtlebergewicht korrelierte auch in dieser Studie mit dem Körpergewicht. Die Gewichte von nicht-ligierten und ligierten Anteilen unterschieden sich nicht zwischen der Sham-Operation und der 70%igen Cholestase. Die Pfortaderligatur mit Cholestase zeigte hier einen wachstumsfördernden Effekt. Nach vier Tagen stieg der Anteil des nicht-ligierten Lebergewichtes nach der Pfortaderligatur nur auf 64 Prozent und nach der Kombination aus Pfortaderligatur und Hauptgallengangsstenose auf 75 Prozent. Yamano et al. untersuchten 40 männliche Wistar-Ratten in drei Modellen: 1.) 70%ige Pfortaderligatur, 2) Hauptgallengangsligatur und 3.) 70%ige Pfortaderli-gatur nach 7 Tagen vorheriger Gallengangsligatur (Yamano et al. 2002). Hier wirkte die Kombination von Cholestase gering wachstumshemmend. Das nicht-ligierte Lebergewicht in Bezug auf das Gesamtlebergewicht stieg am fünften Tag nach der Pfortaderligatur mit Cholestase bis auf 58 Prozent, jedoch nicht so wie bei alleiniger Pfortaderligatur auf 81 Prozent. Andere Autoren beschrieben ebenfalls, dass eine Cholestase das Wachstum des nicht-ligierten Leberabschnittes verringert oder sogar vollständig verhindern kann. Nanashima et al. führten bei 25 Patienten Pfortaderembolisationen durch (Nanashima et al. 2006). Der Unterschied zwischen dem ligierten und dem nicht-ligierten Anteil der Leber war nach der Pfortaderembolisation mit beste-hender Cholestase geringer. Der nicht-embolisierte Anteil war nicht sehr viel größer geworden. Yokoyama et al. erklärten diesen Effekt damit, dass zwar die DNA und RNA bei Pfortaderligatur mit Cholestase erhöht waren, jedoch die Mitose-Indices eine Verringerung der Proliferation der Hepatozyten zeigten (Yokoyama et al. 2007). Als Gründe für das geringere Leberwachstum führten sie an, dass zum einen sich durch die Cholestase die hepatische Hämodynamik geändert habe: die Erweiterung der Gallengänge drücke auf die portalen Zuflüsse, so dass die He-patozyten nicht proliferieren können. Außerdem belegte dieselbe Arbeitsgruppe, dass die leberproliferationsassoziierten Mediatoren wie EGF und IL-6 (Miyoshi et al. 1999) bei der Cholestase verringert sind. Zusätzlich scheint die toxische Galleanreicherung bei der Cholestase einen Fas-abhängigen Apoptose-mechanismus zu induzieren. Auch andere Autoren beschrieben, dass die Cholestase die Produktion von EGF mRNA (Bissig et al. 2000) und IL-6 im Blut (Fujiwara et al. 2001) vermin-dert. Koyama et al. berichteten außerdem, dass die Cholestase aufgrund ver-ringerter mitochondrialer Funktion die metabolische Funktion der Leberzellen reduziert (Koyama et al. 1981). 8.3.2 Laborwerte Unsere Auswertung der Laborwerte nach 120 Stunden zeigte beim Bilirubin (gesamt und direkt), alkalischer Phophatase, ALAT und GLDH einen höheren Anstieg nach der Pfortaderligatur mit Cholestase im Vergleich zur alleinigen Pfortaderligatur. Bei ALAT fiel der Wert nach 120 Stunden bei der Kombination mit der Cholestase im Gegensatz zur alleinigen Pfortaderligatur jedoch noch nicht wieder auf die präoperativen Werte. Gesamteiweiß, Harnstoff und Kreati-nin zeigten in beiden Gruppen keine Veränderungen. Die Funktion der Niere wurde nicht beeinflusst. Ähnlich Unterschiede beschrieben auch andere Autoren. Das Gesamt-Bilirubin sowie die alkalische Phosphatase waren nach Pfortaderligatur mit Cholestase am höchsten. Die erhöhten Transaminasen waren am siebten postoperativen Tag wieder fallend (Nanashima et al. 2006). Bei Mizuno et al. (siehe 8.2.1) stie-gen die ASAT-Werte nach der Pfortaderligatur mit Cholestase nur moderat an, aber der Anstieg war deutlich früher als nach alleiniger Pfortaderligatur und normalisierten sich nach sieben Tagen (Mizuno et al. 1996). Nach der Gallen-gangsligatur stieg das Bilirubin nach dem fünften Tag erwartungsgemäß auf über 119 µmol/l. Bei Yamano et al. (siehe 8.2.1) erhielten sie bei alleiniger Pfor-taderligatur Bilirubin-Werte (gesamt) um 3 µmol/l und bei einer kombinierten Pfortaderligatur mit Cholestase von 22,7 µmol/l bis hin zu 119 µmol/l. (Yamano et al. 2002). Bei den letzten beiden Arbeitsgruppen wuchs der nicht-ligierte Le-beranteil trotz der hohen Werte stark an, während bei anderen Autoren (Imamura et al. 1999) die erhöhten Bilirubinwerte mit einer geringeren Hyper-trophie des nicht-ligierten Lappens einhergingen. Nagino et al. sahen die alkalische Phosphatase neben dem Hinweis auf eine Cholestase auch als einen Marker für Leberregeneration an (Nagino et al. 1999). Georgiev et al. zeigten den zeitlichen Verlauf vom Leberschaden bishin zur Le-berregeneration nach einer Hauptgallengangsligatur bei Mäusen. Der akute Leberschaden zeigte sich durch schnell ansteigende Transaminasen bis zum zweiten Tag nach der Gallengangsligatur. Am fünften Tag wirkte die Leberregneration gemessen an der höchten Anzahl an ki-67-positiven Zellen dem Leberschaden erfolgreich (sinkende ALAT-Werte) entgegen (Georgiev et al. 2008). In unserer Studie hatten die hohen Leberwerte keinen wesentlichen negativen Einfluss auf das Wachstum. Man könnte meinen, dass die Pfortaderliagtur bei einer geschädigten Leber ebenso vielversprechend wäre und der Leberschaden durch die Cholestase den Wachstumserfolg nicht vermindert. 8.3.3 Histologie Die Proliferation der Hepatozyten, angezeigt durch den ki-67-Index, war nach 24 Stunden bei alleiniger Pfortaderligatur höher als bei zusätzlicher Gallen-gangsligatur. Nach 120 Stunden kehrten sich die Verhältnisse aber um: Nach einem deutlichen Schub der Proliferation war der ki-67-Index signifikant höher bei der Pfortaderligatur mit Gallengangsligatur. Die Cholestase förderte bei uns die Proliferation nach 120 Stunden. Auch Yamano et al. (siehe 8.2.1) belegten, dass die zusätzliche Cholestase bei der Pfortaderligatur das Proliferationsmaximum herabsetzt, wobei allerdings über längere Zeit leicht erhöhte Proliferationswerte im Vergleich zur alleinigen Pfortaderligatur nachweisbar waren (Yamano et al. 2002). In dieser Studie war auffällig, dass die cholestatische Leber deutlich langsamer atrophierte, was von den Autoren auf die Fibroseentwicklung und den Gallerückstau zurückgeführt wurde. Azmaiparashvili et al. ligierten bei 30 männlichen Wistar-Ratten (200-220 g) den Hauptgallengang (Azmaiparashvili et al. 2009). Der Mitose-Index als Zeichen der Hepatozytenproliferation zeigte ein Maximum der Proliferation der Hepato-zyten am vierten Tag nach der Gallengangsligatur. Steiner und Martinez ligier-ten ebenfalls den Hauptgallengang und beschrieben danach ein ausgeprägtes Ödem um die großen Gallengänge, was mit einer geringen inflammatorischen Reaktion einherging (Steiner und Martinez 1961). Außerdem waren auch hier ein Ikterus, eine Leberatrophie, ausgedehnte Nekrosebereiche, eine diffuse Fib-rose und Ganghyperplasien nachweisbar. Andere Autoren (Kullak-Ublick und Meier 2000) beschrieben bei einer Choles-tase eine Zunahme der Apoptose und der Nekrose. Bei uns wurden bei alleiniger Pfortaderligatur mehr apoptotische Zellen nach-gewiesen als nach zusätzlicher Gallengangsligatur. Die Cholestase zeigte über-raschender Weise eher eine Abnahme der Apoptose. Der Regenerationsreiz überwiegt zunächst und rückt die Apoptose in den Hintergund. 8.4 Pfortaderligatur mit und ohne Wachstumsfaktoren Das nicht-ligierte Lebergewicht nahm nach 120 Stunden deutlich zu, aber es unterschied sich nicht von den Gruppen, die zusätzlich Wachstumsfaktoren er-hielten. Das gesamte Lebergewicht in Relation zum Körpergewicht unterschied sich nicht im gesamten Zeitverlauf und war zwischen den Gruppen vergleich-bar. Die alkalische Phosphatase war nicht erhöht und es fanden sich ebenfalls keine Unterschiede zwischen den Gruppen. ALAT, GLDH, direktes und gesamtes Bilirubin stiegen nach allen Interventionen vergleichbar. Der durch eine Pforta-derligatur verursachte Leberschaden wurde somit durch die Gabe der Wachs-tumsfaktoren in den nicht-ligierten Leberanteil nicht erkennbar vermindert. Der nicht-ligierte Leberabschnitt zeigte in allen Gruppen eine deutliche Prolife-ration, wobei die Applikation von HGF tendenziell nach 24 Stunden ein höheres Leberwachstum zeigte. Die Apoptose der ligierten Leberabschnitte waren in der PVL niedriger als in den Gruppen mit den Wachstumsfaktoren, während sich die Apoptose in den nicht-ligierten Leberanteilen nicht unterschied. Die Apopto-se in den ligierten Leberabschnitten wurden durch die Wachstumsfaktoren ge-hemmt. 8.4.1 Epidermal growth factor EGF bindet an EGF-Rezeptoren auf der Oberfläche der Hepatozyten und indu-zieren eine Zellproliferation. Bisher wurden keine Studien publiziert, die die por-talvenöse Gabe von EGF nach Pfortaderligatur überprüft haben. Es könnten deshalb nur tierexperimentelle Ergebnisse diskutiert werden, die EGF und seine Rezeptoren in der Leber betrachten. Webber et al. beschrieben in einem in vivo Ratten-Modell, dass die Infusion von bis zu 80 µg TGFa und EGF in die Pfortader nach 24 Stunden kaum einen Ef-fekt auf die DNA-Synthese bei einer gesunden, unbehandelten Leber bewirkte (Webber et al. 1994). HGF führte dagegen bei einer normalen Leber zur dreifa-chen Steigerung der DNA-Synthese. Nach einer 30%igen Leberresektion führ-ten 40 µg EGF zu einer dreifachen Steigerung, TGFa und HGF sogar zu einer sechsfachen Steigerung der DNA-Synthese im Vergleich zu einer Leberresekti-on ohne zusätzliche Gabe von Wachstumsfaktoren. Bei einer 30%igen Resekti-on hatte EGF somit einen stimulierenden Effekt auf die DNA-Synthese. Baier et al. verglichen bei 70 Sprague-Dawley Ratten (350-500 g) eine 80%ige Hepatektomie mit einer Ischämie und Reperfusion (Baier et al. 2006). Nach je-weils 0.5, 2, 6, 12, 24 und 72 Stunden wurde die Expression von EGF-, FGF- (Fibroblast growth factor), HGF- und TNF1-Rezeptoren bestimmt. Sowohl nach 80%iger Hepatektomie als auch nach der Ischämie und Reperfusion war die Expression von allen Rezeptoren nach 6, 12 und 72 Stunden erhöht. Nach 24 Stunden wurde aber eine ausgeprägte Verminderung der Rezeptoren festge-stellt. Die Arbeitsgruppe vermutete, dass die therapeutische Gabe von Wachs-tumsfaktoren 24 Stunden nach einem Leberschaden aufgrund der niedrigern Rezeptorenzahl nicht erfolgversprechend sein könnte. Auch bei unserer Arbeit war das Leberwachstum von der HGF- und von der EGF-Gruppe nach 24 Stunden etwas geringer ausgefallen als nach der Gabe von EPO. Nach 120 Stunden lag das nicht-ligierte Leberwachstum von der EPO-Gruppe wieder zu-rück. Ishii et al. beschrieben in ihrer Studie an Wistar-Ratten den Einfluss von EGF (25 µg/kg/d) nach 70%iger Hepatektomie (Ishii et al. 1995). Nach vier Tagen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen dem relativen Leberge-wicht der Kontrollgruppe (4,20 ± 0,07 Prozent) und der EGF-Gruppe (4,13 ± 0,13 Prozent). Auch die Regenerationsrate unterschied sich bei der Kontrolle von 92,0 ± 3,1 Prozent und bei EGF von 97,1 ± 4,4 Prozent nur gering. Auch in unserer Studie war der wachstumsfördernde Reiz von intraportal appli-zierten EGF nur marginal ausgeprägt, so dass man von der portalvenösen EGF-Applikaton neben der Pfortaderligatur keine große klinische Relevanz er-warten kann. 8.4.2 Erythropoetin Bockhorn et al. untersuchten den Effekt von EPO nach 70%iger und 90%iger Leberresektion sowie 30%iger Lebertransplantation bei männlichen Lewis Rat-ten (250-300 g) (Bockhorn et al. 2008). EPO oder hitze-inaktiviertes EPO als Placebo wurden präoperativ intraperitoneal und intraoperativ intravenös appli-ziert. Vor Versuchsbeginn wurde die optimale Dosierung des EPO mit 3 x 1 IU/g Körpergewicht an drei verschiedenen Tagen ermittelt. Bei beiden partiellen He-patektomien entsprach die zunehmende Zellmasse der steigenden Proliferation (ki-67-Indexzahl). Sowohl nach der 70%igen als auch der 90%igen Hepatekto-mie wurde eine deutliche Zunahme der Proliferation festgestellt. Nach der Le-bertransplantation mit EPO stieg die Lebermasse nach 24 Stunden im Vergleich zur Kontrollgruppe an, die Apoptose (TUNEL) verminderte sich, aber die Prolife-ration unterschied sich nicht. Greif et al. überprüften an 90 männlichen Wistar-Ratten (250-300 g), ob präope-rativ appliziertes rhEPO nach Leberresektion einen positiven Einfluss auf die Leberregeneration ausübt (Greif et al. 2010). Alle Tiere wurden in drei Gruppen eingeteilt: Sham-Operation oder 70%ige Leberresektion mit rhEPO oder Koch-salzlösung. In der rhEPO-Gruppe war ein vermehrtes Lebergewicht und erhöhte kurzfristige Proliferation nachweisbar. Die Apoptose unterschied sich nicht. Schmeding et al. untersuchten männliche Wistar-Ratten (230-270 g), um den stimulierenden Effekt von rhEPO nach 70%iger und 90%iger Hepatektomie zu überprüfen (Schmeding et al. 2008). Dazu wurde das rhEPO entweder einmalig intraportal während der Operation (4000 IU/kg rhEPO) oder postoperativ subku-tan über drei Tage (12000 IU/kg rhEPO) appliziert oder nur Kochsalzlösung in die Portalvene injiziert (Kontrolle). EPO hatte einen wachstumsfördernden Ef-fekt, der bei der intraportalen Gabe höher war als bei der subkutanen Gabe. Die Proliferationen waren deutlich höher als in der Kontrollgruppe. Le Minh et al. fanden an männlichen Mäusen heraus, dass die Gabe von Darbepetin-a in den retrobulbären Venenplexus bei induziertem, akutem Leber-versagen die intrahepatische Entzündungsreaktion, der Leberschaden sowie die Apoptoserate vermindert werden konnte (Le Minh et al. 2007). Andere tierexperimentelle Studien, die die intraportale Gabe von Erythropoetin nach einer Pfortaderligatur untersuchten, wurden bisher nicht veröffentlicht. In unserer Studie war der Einfluss von EPO nicht so deutlich, so dass der potenti-elle Nutzen von EPO weiterhin klärungsbedürftig ist. 8.4.3 Hepatocyte growth factor Ishii et al. untersuchten an Wistar-Ratten den Einfluss von rhHGF auf die Leber-regeneration nach 70%iger Hepatektomie (Ishii et al. 1995). Sie applizierten entweder Kochsalzlösung, rhHGF (100 µg/kg/d) oder rhHGF (100 µg/kg/d) mit Heparin (500 µg/kg/d) über eine intravenös implantierte Pumpe. Nach der Le-berresektion konnte das Leberwachstum und die Regenerationsrate durch rhHGF im Vergleich zur Kontrolle deutlich gesteigert werden. Eine weitere Sti-mulation des Wachstums war durch zusätzliche, gleichzeitige Gabe von Hepa-rin möglich. Die Autoren vermuteten, dass die zusätzliche Gabe von Heparin zur verminderten Metabolisierung des HGFs führt und somit für das erhöhte Wachstum verantwortlich sein könnte. Nishino et al. beschrieben in ihrer Studie an 108 Sprague-Dawley-Ratten die Effekte der präoperativen Gabe von humanem HGF Genplasmid nach 70%iger Hepatektomie bei bestehender Zirrhose (Nishino et al. 2008). Sie führten bei allen Tieren eine 2/3 Leberresektion durch und untersuchten drei Gruppen: 1.) mit einer gesunden Leber, 2.) mit einer zirrhotischen Leber und HGF und 3.) mit einer zirrhotischen Leber und Placebo-Injektion. Die Zirrhose wurde durch die Vorbehandlung mit Dimethylnitrosamine (DNM) über vier Wochen induziert. In ihrem Modell applizierten sie 72 Stunden vor der 70%igen Hepatektomie HGF-HVJ-Liposome (HVJ = hemagglutinating virus of Japan). Der BrdU-Index als immunhistochemischer Proliferationsindex zeigte bis 12 Stunden nach der Ope-ration keine Proliferation. Die Überlebensrate der Ratten in der zirrhotischen Gruppe wurde durch HGF im Vergleich zur Placebo-Gruppe deutlich gesteigert. Die Leberregenerationsrate wurde zwar durch HGF nicht gesteigert, aber die Apoptose wurde von ca. 5 Prozent TUNEL-positiven Hepatozyten auf 1 Prozent durch die Gabe von HGF reduziert. Die Verwendung von Liposomen in dieser Studie ist ein interessanter Ansatz, da durch die Liposomen die Gefahr der verfrühten Ausscheidung verringert wird und die Chance vergrößert wird, dass HGF und auch rhHGF bei seiner kurzen Halbwertszeit von 3-5 Minuten (Kawaida et al. 1994, Liu et al. 1992) zu seinem Bestimmungsort gelangen kann. Kaido et al. überprüften an 40 F344-Ratten, ob die Gabe von HGF in der rese-zierten zirrhotischen Leber das Überleben verbessert. Nach Induktion einer Le-berzirrhose ligierten die Untersucher 70% der Pfortader und infundierten ent-weder rhHGF oder Kochsalzlösung in die Milz. Vier Tage später wurde in bei-den Gruppen eine 70%ige Hepatektomie vorgenommen (Kaido et al. 1998). Die Überlebensrate nach 48 Stunden betrug ohne rhHGF 20 Prozent und mit rhHGF 75 Prozent. Am vierten Tag betrug die Lebergröße in der rhHGF-Gruppe 49 ± 4,4 Prozent und in der Kontrollgruppe 38,9 ± 3,6 Prozent. Die rhHGF-Gabe über eine osmotische Pumpe regt das Leberwachstum an und steigert nach 48 Stunden die Überlebensrate bei einer zirrhotischen Leber nach einer partiellen Hepatektomie. Ueno et al. untersuchten an 23 Hunden den Einfluss des HGF auf die Leberre-generation nach Pfortaderastligatur des linken Astes bei zirrhotischen Lebern (Ueno et al. 1996). In ihrem Modell applizierten sie im Intervall 0, 5, 12, 24 und 48 Stunden entweder rhHGF (255 ng/kg) oder Kochsalz (Kontrolle) per Bolus über einen Katheter in die Pfortader. 14 Tage nach der Pfortaderastligatur wur- den die Tiere getötet. In der HGF-Gruppe nahm das Lebergewicht sowohl in den ligierten als auch in den nicht-ligierten Abschnitten deutlich zu. In den nicht-ligierten Abschnitten vergrößerten sich die Hepatozyten und die DNA-Synthese nahm zu. Die Blutwerte ALAT, alkalische Phosphatase, Bilirubin sowie die Clea-rance-Ratio von Indocyanin grün als Ausdruck der Leberfunktion zeigten zwi-schen den beiden Gruppen keinen Unterschied. Yoshikawa et al. überprüften an 30 F344-Ratten, ob rhHGF die Leberregenera-tion bei cholestatischen Ratten mit nachfolgender 70%iger Hepatektomie ver-bessert (Yoshikawa et al. 1998). Den Tieren wurde präoperativ und zwölfstünd-lich postoperativ entweder rhHGF oder Placebo intraperitoneal injiziert. Das Gewicht des nicht-ligierten Anteils (rechte und kaudaler Lappen) war in der rhHGF-Gruppe deutlich höher als in der Kontrollgruppe (p<0,05). Die Serumbili-rubinkonzentration normalisierte sich nach 24 Stunden in der rhHGF-Gruppe, während er in der Kontrollgruppe weiterhin erhöht blieb. Die BrdU-positive Zel-len als Ausdruck der Proliferation waren in der rhHGF-Gruppe höher als in der Kontrollgruppe angestiegen. Allerdings verminderten sich die Proliferationen nach 48 Stunden in der rhHGF-Gruppe und in der Kontrollgruppe. Auch in un-serer Studie stieg die Proliferation nach 24 Stunden unter HGF-Gabe an und verminderte sich nach 120 Stunden. Kaido et al. untersuchten an 50 F344-Ratten, ob die Gabe von rhHGF bei nor-maler Leber oder bei induzierter Cholestase die Hypertrophie beeinflusst, wenn eine 70%ige Pfortaderligatur vorgenommen wird (Kaido et al. 1999). Die Tiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt. In der Verschlussikterusgruppe wurde der Gallengang drei Tage vor der Pfortaderligatur unterbunden, um eine Cholestase zu simulieren, und in der anderen Gruppe blieb die Leber unbehandelt. Bei al-len Tieren wurde eine 70%ige Pfortaderligatur angelegt und entweder rhHGF oder ein Placebo kontinuierlich über eine osmotische Pumpe intraperitoneal infundiert. Die hepatozelluläre Proliferation war nach rhHGF-Gabe im Vergleich zur Placebo-Gruppe deutlich erhöht. Dieser Effekt war bei den Tieren mit dem Verschlussikterus in der Cholestase-Gruppe nicht so ausgeprägt. Die Prolifera-tion nahm bereits nach zwei Tagen ab. In allen genannten Studien induzierte HGF einen Anstieg der DNA-Synthese, eine Lebervergrößerung oder eine Steigerung der Überlebensrate. Diese Effek-te waren in den unterschiedlichsten Modellen nachweisbar. In unserer Studie war der Effekt von HGF im Vergleich zu den beiden anderen getesteten Wachtsumsfaktoren viel versprechend besonders in Hinblick auf die Proliferati-onsrate nach 24 Stunden. Möglicherweise könnte eine kontinuierliche oder mehrfache Gabe von HGF erforderlich sein, um den Erfolg noch zu steigern. 9 Schlussfolgerung Wir konnten in unserer Studie belegen, dass eine Pfortaderligatur mit und ohne Gallengangsokklusion in einem tierexperimentellen Modell an Wistar-Ratten sicher und verlässlich durchführbar sind, weil die konsekutive Hypertrophie des nicht-ligierten Leberanteiles und die Atrophie des ligierten Leberabschnitts überall nachweisbar waren. Im Vergleich der Sham- und der PVL-Gruppe traten die in der Literatur hinreichend belegten Veränderungen auf, so dass wir damit die Validität unseres Modells bestätigen konnten. Die 70%ige Pfortaderligatur in Kombination mit einer Ligatur des Hauptgallen-ganges simulierte die klinische Situation einer partiellen Pfortaderligatur in einer cholestatischen Leber. In solchen Situationen besteht die Gefahr, dass die in-trahepatische Cholestase das Wachstum des nicht-ligierten Leberanteils hem-men könnte, denn eine Cholestase führt normalerweise zu einer Atrophie des gestauten Leberabschnittes. Die Ergebnisse in der Literatur und in unserer Stu-die sind nicht eindeutig. Neben einem wachstumsfördernden Einfluss durch die Pfortaderligatur wurde immer wieder der schädliche Einfluss durch die Choles-tase beschrieben. Es gibt Hinweise für eine stimulierte Genaktivität der Hepato-zyten und eine beschleunigte Regeneration bei bestehender Cholestase. In un-serer Studie war nur ein schwacher Wachstumsschub nachweisbar, so dass der klinische Effekt marginal sein dürfte. Der stimulierende Effekt der Wachstumsfaktoren auf die Hypertrophie des nicht-ligierten Leberanteiles war deutlich schwächer als erwartet. Nur die Applikation von HGF zeigte eine viel versprechende Tendenz zur Steigerung der Leberhy-pertrophie im Vergleich zur einfachen Pfortaderligatur. Es ist zudem denkbar, dass der einmalige intraportale Bolus von HGF zu gering war und sich der posi-tive Effekt durch eine andere Applikationsweise noch steigern ließ. Ein neuer Ansatz könnte die Betrachtung des Effektes einer intraportalen HGF-Gabe in eine cholestasegeschädigte Leber sein. Wir verzichteten in unserer Studie auf eine Leberresektion, so dass der tatsäch-liche Zuwachs an funktionellem Gewebe unklar bleibt. Der Einfluss der hepatotropen Wachtsumsfaktoren auf Lebermalignome wurde hier ebenfalls nicht beleuchtet. 10 Literaturverzeichnis Abdalla EK, Hicks ME, Vauthey JN. 2001. Portal vein embolization: rationale, technique and future prospects. Br J Surg, 88(2):165-175. Azmaiparashvili E, Kordzaia D, Dzidziguri D. 2009. Biliary hypertension as the cell proliferation trigger in bile duct ligated rats. Georgian Med News,(168):111-116. Baier P, Wolf-Vorbeck G, Hempel S et al. 2006. Effect of liver regeneration after partial hepatectomy and ischemia-reperfusion on expression of growth factor receptors. World J Gastroenterol, 12(24):3835-3840. Bissig KD, Marti U, Solioz M et al. 2000. Epidermal growth factor is decreased in liver of rats with biliary cirrhosis but does not act as paracrine growth factor immediately after hepatectomy. J Hepatol, 33(2):275-281. Bockhorn M, Fingas CD, Rauen U et al. 2008. Erythropoietin treatment improves liver regeneration and survival in rat models of extended liver resection and living donor liver transplantation. Transplantation, 86(11):1578-1585. Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL et al. 1991. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science, 251(4995):802-804. de Graaf W, van den Esschert JW, van Lienden KP et al. 2010. A rabbit model for selective portal vein embolization. J Surg Res, 171(2):486-494. Di Stefano DR, de BT, Denys A et al. 2005. Preoperative percutaneous portal vein embolization: evaluation of adverse events in 188 patients. Radiology, 234(2):625-630. Fausto N, Campbell JS, Riehle KJ. 2006. Liver regeneration. Hepatology, 43(2 Suppl 1):45-53. Fisher JW, Koury S, Ducey T et al. 1996. Erythropoietin production by interstitial cells of hypoxic monkey kidneys. Br J Haematol, 95(1):27-32. Fujiwara K, Nagoshi S, Ohno A et al. 1993. Stimulation of liver growth by exogenous human hepatocyte growth factor in normal and partially hepatectomized rats. Hepatology, 18(6):1443-1449. Fujiwara Y, Shimada M, Yamashita Y et al. 2001. Cytokine characteristics of jaundice in mouse liver. Cytokine, 13(3):188-191. Furrer K, Tian Y, Pfammatter T et al. 2008. Selective portal vein embolization and ligation trigger different regenerative responses in the rat liver. Hepatology, 47(5):1615-1623. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. 1992. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 119(3):493-501. Georgiev P, Jochum W, Heinrich S et al. 2008. Characterization of time-related changes after experimental bile duct ligation. Br J Surg, 95(5):646-656. Gerdes J, Lemke H, Baisch H et al. 1984. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol, 133(4):1710-1715. Goto Y, Nagino M, Nimura Y. 1998. Doppler estimation of portal blood flow after percutaneous transhepatic portal vein embolization. Ann Surg, 228(2):209-213. Greengard O, Federman M, Knox WE. 1972. Cytomorphometry of developing rat liver and its application to enzymic differentiation. J Cell Biol, 52(2):261-272. Hasuike S, Ido A, Uto H et al. 2005. Hepatocyte growth factor accelerates the proliferation of hepatic oval cells and possibly promotes the differentiation in a 2-acetylaminofluorene/partial hepatectomy model in rats. J Gastroenterol Hepatol, 20(11):1753-1761. Hayashi H, Beppu T, Sugita H et al. 2010. Serum HGF and TGF-beta1 levels after right portal vein embolization. Hepatol Res, 40(4):311-317. Higgins GM, Anderson RM. Experimental pathology of liver: restoration of liver of the white rat following partial surgical removal. Arch.Pathol 365, 179-183. 1931. Honjo I, Suzuki T, Ozawa K et al. 1975. Ligation of a branch of the portal vein for carcinoma of the liver. Am J Surg, 130(3):296-302. Imamura H, Shimada R, Kubota M et al. 1999. Preoperative portal vein embolization: an audit of 84 patients. Hepatology, 29(4):1099-1105. Ishii T, Sato M, Sudo K et al. 1995. Hepatocyte growth factor stimulates liver regeneration and elevates blood protein level in normal and partially hepatectomized rats. J Biochem, 117(5):1105-1112. Jacobson LO, Goldwasser E, Fried W et al. 1957. Role of the kidney in erythropoiesis. Nature, 179(4560):633-634. Kaido T, Seto S, Yamaoka S et al. 1998. Perioperative continuous hepatocyte growth factor supply prevents postoperative liver failure in rats with liver cirrhosis. J Surg Res, 74(2):173-178. Kaido T, Yoshikawa A, Seto S et al. 1999. Hepatocyte growth factor supply accelerates compensatory hypertrophy caused by portal branch ligation in normal and jaundiced rats. J Surg Res, 85(1):115-119. Kaneko T, Nakao A, Takagi H. 2002. Clinical studies of new material for portal vein embolization: comparison of embolic effect with different agents. Hepatogastroenterology, 49(44):472-477. Kawaida K, Matsumoto K, Shimazu H et al. 1994. Hepatocyte growth factor prevents acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 91(10):4357-4361. Key G, Kubbutat MH, Gerdes J. 1994. Assessment of cell proliferation by means of an enzyme-linked immunosorbent assay based on the detection of the Ki-67 protein. J Immunol Methods, 177(1-2):113-117. Kinoshita H, Sakai K, Hirohashi K et al. 1986. Preoperative portal vein embolization for hepatocellular carcinoma. World J Surg, 10(5):803-808. Kollmar O, Corsten M, Scheuer C et al. 2007. Portal branch ligation induces a hepatic arterial buffer response, microvascular remodeling, normoxygenation, and cell proliferation in portal blood-deprived liver tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 292(6):1534-1542. Koury ST, Bondurant MC, Koury MJ et al. 1991. Localization of cells producing erythropoietin in murine liver by in situ hybridization. Blood, 77(11):2497-2503. Koyama K, Takagi Y, Ito K et al. 1981. Experimental and clinical studies on the effect of biliary drainage in obstructive jaundice. Am J Surg, 142(2):293-299. Kraus GE, Beltran A. 1959. Effect of induced infarction on rat liver implanted with Walker carcinoma 256. Arch Surg, 79769-774. Kullak-Ublick GA, Meier PJ. 2000. Mechanisms of cholestasis. Clin Liver Dis, 4(2):357-385. Kuratowska Z, Lewartowski B, Michalak E. 1961. Studies on the production of erythropoietin by isolated perfused organs. Blood, 18:527-534. Kusashio K, Shimizu H, Kimura F et al. 2009. Effect of excessive acute-phase response on liver regeneration after partial hepatectomy in rats. Hepatogastroenterology, 56(91-92):824-828. Lambotte L, Li B, Leclercq I et al. 2000. The compensatory hyperplasia (liver regeneration) following ligation of a portal branch is initiated before the atrophy of the deprived lobes. J Hepatol, 32(6):940-945. Le Minh K, Klemm K, Abshagen K et al. 2007. Attenuation of inflammation and apoptosis by pre- and posttreatment of darbepoetin-alpha in acute liver failure of mice. Am J Pathol, 170(6):1954-1963. Lee KC, Kinoshita H, Hirohashi K et al. 1993. Extension of surgical indications for hepatocellular carcinoma by portal vein embolization. World J Surg, 17(1):109-115. Liu KX, Kato Y, Narukawa M et al. 1992. Importance of the liver in plasma clearance of hepatocyte growth factors in rats. Am J Physiol, 263(5):G642-G649. Makuuchi M, Thai BL, Takayasu K et al. 1990. Preoperative portal embolization to increase safety of major hepatectomy for hilar bile duct carcinoma: a preliminary report. Surgery, 107(5):521-527. Matela J, Zabavnik Z, Jukic T et al. 2005. Selective portal vein embolization as introduction in major surgery. Coll Antropol, 29(1):163-167. Matsuda Y, Matsumoto K, Ichida T et al. 1995. Hepatocyte growth factor suppresses the onset of liver cirrhosis and abrogates lethal hepatic dysfunction in rats. J Biochem, 118(3):643-649. Matsumoto K, Nakamura T. 1992. Hepatocyte growth factor: molecular structure, roles in liver regeneration, and other biological functions. Crit Rev Oncog, 3(1-2):27-54. Matsumoto K, Tajima H, Okazaki H et al. 1992. Negative regulation of hepatocyte growth factor gene expression in human lung fibroblasts and leukemic cells by transforming growth factor-beta 1 and glucocorticoids. J Biol Chem, 267(35):24917-24920. McCormick D, Chong H, Hobbs C et al. 1993. Detection of the Ki-67 antigen in fixed and wax-embedded sections with the monoclonal antibody MIB1. Histopathology, 22(4):355-360. Michalopoulos GK. 2007. Liver regeneration. J Cell Physiol, 213(2):286-300. Mitchell C, Nivison M, Jackson LF et al. 2005. Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor links hepatocyte priming with cell cycle progression during liver regeneration. J Biol Chem, 280(4):2562-2568. Miyoshi H, Rust C, Roberts PJ et al. 1999. Hepatocyte apoptosis after bile duct ligation in the mouse involves Fas. Gastroenterology, 117(3):669-677. Mizuno S, Nimura Y, Suzuki H et al. 1996. Portal vein branch occlusion induces cell proliferation of cholestatic rat liver. J Surg Res, 60(1):249-257. Mueller L, Grotelueschen R, Meyer J et al. 2003. Sustained function in atrophying liver tissue after portal branch ligation in the rat. J Surg Res, 114(2):146-155. Nagino M, Nimura Y, Kamiya J et al. 1999. Serum alkaline phosphatase after extensive liver resection: a study in patients with biliary tract carcinoma. Hepatogastroenterology, 46(26):766-770. Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP et al. 1991. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MET. Oncogene, 6(4):501-504. Nanashima A, Sumida Y, Shibasaki S et al. 2006. Parameters associated with changes in liver volume in patients undergoing portal vein embolization. J Surg Res, 133(2):95-101. Natarajan A, Wagner B, Sibilia M. 2007. The EGF receptor is required for efficient liver regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A, 104(43):17081-17086. Nishino M, Iimuro Y, Ueki T et al. 2008. Hepatocyte growth factor improves survival after partial hepatectomy in cirrhotic rats suppressing apoptosis of hepatocytes. Surgery, 144(3):374-384. Ozawa K, Takasan H, Kitamura O et al. 1971. Effect of ligation of portal vein on liver mitochondrial metabolism. J Biochem, 70(5):755-764. Picard C, Starkel P, Sempoux C et al. 2004. Molecular mechanisms of apoptosis in the liver of rats after portal branch ligation with and without retrorsine. Lab Invest, 84(5):618-628. Rahbari NN, Garden OJ, Padbury R et al. 2011. Posthepatectomy liver failure: a definition and grading by the International Study Group of Liver Surgery (ISGLS). Surgery, 149(5):713-724. Rauchfuss F, Lambeck S, Claus RA et al. 2012. Sustained liver regeneration after portal vein embolization --a human molecular pilot study. Dig Liver Dis, 44(8):681-688. Robert Koch-Institut. 2012. Krebs in Deutschland 2007/2008. Achte Ausgabe. Berlin. Rous P, Larimore LD. 1920. Relation of the portal blood to liver maintenance: a demonstration of liver atrophy conditional on compensation. J Exp Med, 31(5):609-632. Rubin JS, Bottaro DP, Aaronson SA. 1993. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product. Biochim Biophys Acta, 1155(3):357-371. Schmeding M, Boas-Knoop S, Lippert S et al. 2008. Erythropoietin promotes hepatic regeneration after extended liver resection in rats. J Gastroenterol Hepatol, 23(7 Pt 1):1125-1131. Schmidt RF, Lang F, Thews G. 2005. Physiologie des Menschen. neunundzwanzigste Aufl. Heidelberg: Springer Medizin Verlag. Schweizer W, Duda P, Tanner S et al. 1995. Experimental atrophy/hypertrophy complex (AHC) of the liver: portal vein, but not bile duct obstruction, is the main driving force for the development of AHC in the rat. J Hepatol, 23(1):71-78. Steiner PE, Martinez JB. 1961. Effects on the Rat Liver of Bile Duct, Portal Vein and Hepatic Artery Ligations. Am J Pathol, 39(3):257-289. Sugimoto T, Yamada T, Iwata H et al. 2009. Two-stage portal vein ligation facilitates liver regeneration in rats. Eur Surg Res, 42(3):181-188. Suzuki H, Iyomasa S, Nimura Y et al. 1994. Internal biliary drainage, unlike external drainage, does not suppress the regeneration of cholestatic rat liver after partial hepatectomy. Hepatology, 20(5):1318-1322. Tanaka H, Kinoshita H, Hirohashi K et al. 1994. Increased safety by two-stage hepatectomy with preoperative portal vein embolization in rats. J Surg Res, 57(6):687-692. Terasaki M, Kuriki H, Nimura Y et al. 1991. Induction of DNA replication and cell growth in rat liver by obstructive jaundice. Jpn J Cancer Res, 82(2):170-175. Uemura T, Miyazaki M, Hirai R et al. 2000. Different expression of positive and negative regulators of hepatocyte growth in growing and shrinking hepatic lobes after portal vein branch ligation in rats. Int J Mol Med, 5(2):173-179. Ueno S, Aikou T, Tanabe G et al. 1996. Exogenous hepatocyte growth factor markedly stimulates liver regeneration following portal branch ligation in dogs. Cancer Chemother Pharmacol, 38(3):233-237. van den Esschert JW, van Lienden KP, de GW et al. 2011. Portal vein embolization induces more liver regeneration than portal vein ligation in a standardized rabbit model. Surgery, 149(3):378-385. van Gulik TM, Kloek JJ, Ruys AT et al. 2011. Multidisciplinary management of hilar cholangiocarcinoma (Klatskin tumor): extended resection is associated with improved survival. Eur J Surg Oncol, 37(1):65-71. Webber EM, Godowski PJ, Fausto N. 1994. In vivo response of hepatocytes to growth factors requires an initial priming stimulus. Hepatology, 19(2):489-497. Weinbren K. 1953. The effect of bile duct obstruction on regeneration of the rat's liver. Br J Exp Pathol, 34(3):280-289. Yamano T, Hirai R, Hato S et al. 2002. Delayed liver regeneration with negative regulation of hepatocyte growth factor and positive regulation of transforming growth factor-beta1 mRNA after portal branch ligation in biliary obstructed rats. Surgery, 131(2):163-171. Yasuda H, Imai E, Shiota A et al. 1996. Antifibrogenic effect of a deletion variant of hepatocyte growth factor on liver fibrosis in rats. Hepatology, 24(3):636-642. Yokoyama Y, Nagino M, Nimura Y. 2007. Mechanism of impaired hepatic regeneration in cholestatic liver. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 14(2):159-166. Yokoyama Y, Nagino M, Nimura Y. 2007. Mechanisms of hepatic regeneration following portal vein embolization and partial hepatectomy: a review. World J Surg, 31(2):367-374. Yoshikawa A, Kaido T, Seto S et al. 1998. Hepatocyte growth factor promotes liver regeneration with prompt improvement of hyperbilirubinemia in hepatectomized cholestatic rats. J Surg Res, 78(1):54-59. Zanjani ED, Poster J, Burlington H et al. 1977. Liver as the primary site of erythropoietin formation in the fetus. J Lab Clin Med, 89(3):640-644. 11 Anhang Tab. 2: Laborwerte von direktem Bilirubin [µmol/l] im Median (Range) präoperativ, postoperativ und nach 120 Stunden im Vergleich zwischen Kontrolle, PVL, EGF und EPO Präoperativ Postoperativ Nach 120 Stunden Kontrolle 0,5 (0,1-0,8) 0,6 (0,4-1,0) 0,9 (0,7-1,3) PVL 0,6 (0,3-1,0) 1,0 (0,7-6,6) 1,1 (0,3-1,4) EGF 0,7 (0,6-0,7) 1,0 (0,8-1,3) 1,2 (1,1-3,6) EPO 1,0 (0,6-1,1) 1,3 (0,9-1,5) 1,6 (1,1-2,6) Tab. 3: Laborwerte von Harnstoff [mmol/l] im Median (Range) präoperativ, postope-rativ und nach 120 Stunden im Vergleich zwischen Kontrolle, PVL, EGF und EPO Präoperativ Postoperativ Nach 120 Stunden Kontrolle 7,4 (6,4-8,8) 7,4(6,6-9,1) 6,1 (5,8-7,4) PVL 7,7 (6,9-8,9) 8,3 (7,0-9,5) 7,2 (6,7-7,8) EGF 8,1 (7,3-8,4) 9,2 (8,0-10,0) 7,1 (6,2-8,2) EPO 8,1 (6,7-9,0) 9,0 (7,6-10,2) 7,0 (5,5-7,8) Tab. 4: Laborwerte von Kreatinin [µmol/l] im Median (Range) präoperativ, postopera-tiv und nach 120 Stunden im Vergleich zwischen Kontrolle, PVL, EGF und EPO Präoperativ Postoperativ Nach 120 Stunden Kontrolle 50,3 (38,8-56,4) 46,3 (41,3-53,5) 45,8 (34,6-48,0) PVL 39,2 (35,2-41,7) 44,0 (39,6-46,2) 38,5 (37,4-42,7) EGF 49,3 (44,3-51,7) 56,6 (52,6-59,6) 40,3 (38,3-48,1) EPO 44,5 (36,4-52,3) 54,5 (38,6-61,2) 44,1 (39,4-47,5) Tab. 5: Laborwerte von Gesamteiweiß [g/l] im Median (Range) präoperativ, posto-perativ und nach 120 Stunden im Vergleich zwischen Kontrolle, PVL, EGF und EPO Präoperativ Postoperativ Nach 120 Stunden Kontrolle 65,9 (60,5-70,5) 60,5 (58,5-62,8) 57,1 (53,5-66,9) PVL 63,8 (59,9 -65,6) 54,7 (52,8-55,1) 57,2 (56,1-57,6) EGF 65,3 (61,0-74,0) 52,1 (49,9-61,1) 55,5 (47,9-58,7) EPO 67,2 (62,6-72,5) 52,8 (45,4-55,5) 58,6 (49,7-62,4) Lebenslauf Name: Annika Marissa Böhm Geburtsdatum: 20.06.1988 Geburtsort: Düsseldorf Eltern: Vater: Bartholomäus Böhm, Arzt Mutter: Anke Böhm, Hausfrau Wohnung: Hundskapfklinge 26,72072 Tübingen Familienstand: ledig Schulausbildung: 1994-2000 Ludwig-Heck-Grundschule in Berlin 2000-2002 Eckener-Gymnasium in Berlin 2002-2006 Evangelisches Ratsgymnasium in Erfurt, Allgemeine Hochschulreife Studium: 2006-2012 Friedrich-Schiller-Universität in Jena Beruf: 2013- Augenklinik der Eberhard-Karls- Universität Tübingen, Assistenzärztin Ehrenwörtliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist, ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle von mir benutzten Hilfsmit-tel, persönlichen Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben sind, mich Herr Dr. Falk Rauchfuß bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts unterstützt hat, sowie Prof. Dr. Dr. Bartholomäus Böhm bei der statistischen Auswertung bei SPSS, die Hilfe eines Promotionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde und dass Dritte weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, dass ich die Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere wissenschaftliche Prüfung eingereicht habe und dass ich die gleiche, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Ab-handlung nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht habe. Tübingen, den 14.05.2013 Unterschrift des Verfassers