Kopplung von Retinolsäure an einen anti-Neuroblastom-
Antikörper und Testung des Immunkonjugates als
Differenzierungsinduktor
- In vitro und in vivo Untersuchungen -
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Conny Schlick
geboren am 22.05.1975 in Karl-Marx-Stadt
Gutachter
1: Prof. Dr. Felix Zintl
2: Dr. Alexander Berndt
3: Prof. Dr. Frank Berthold
Tag der öffentlichen Verteidigung: 14. Juni 2004
Inhaltsverzeichnis
2
Inhaltsverzeichnis
1 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................... 4
2 Zusammenfassung................................................................................. 5
3 Einleitung.............................................................................................. 8
3.1 Neuroblastom ................................................................................... 8
3.2 Retinolsäure.................................................................................... 12
3.3 Monoklonale Antikörper ................................................................... 16
3.4 In vivo-Tumormodelle ..................................................................... 20
4 Ziele der Arbeit .....................................................................................22
5 Material und Methoden .........................................................................23
5.1 Chemikalien .................................................................................... 23
5.2 Monoklonale Antikörper für Untersuchungen..................................... 23
5.3 Zellkultur ........................................................................................ 25
5.4 Laborgeräte .................................................................................... 25
5.5 Materialien...................................................................................... 26
5.6 Monoklonale Antikörper für die Immunkonjugation............................ 26
5.7 Retinolsäure.................................................................................... 27
5.8 Konjugation von Retinolsäure und einem monoklonalen Antikörper .... 28
5.8.1 Mediator ....................................................................................28
5.8.2 Vorbereitung des Antikörpers ......................................................28
5.8.3 Vorbereitung der Retinolsäure .....................................................29
5.8.4 Kopplung ...................................................................................29
5.8.5 Vorbereitung des Konjugates für die Versuche..............................31
5.9 In vitro-Testung der Konjugate ........................................................ 32
5.9.1 Konzentrationsbestimmung .........................................................32
5.9.2 Bindungsfähigkeit der Konjugate .................................................36
5.9.3 Beeinflussung des Zellwachstums ................................................37
5.10 Versuchstiere ................................................................................. 38
5.11 Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Modells ................................... 39
5.11.1 Tumorzellen .............................................................................39
5.11.2 Modelletablierung .....................................................................39
Inhaltsverzeichnis
3
5.12 In vivo-Experimente ....................................................................... 41
5.12.1 Letale Dosis der all- trans-Retinolsäure .......................................41
5.12.2 Beeinflussung des Tumorwachstums durch Immunkonjugate ......42
5.12.3 Postmortale Untersuchung der Versuchstiere..............................42
5.12.4 Beeinflussung der Überlebenszeit durch Immunkonjugate...........43
5.12.5 Immunzytologische Färbung......................................................44
5.13 Statistische Auswertung.................................................................. 45
6 Ergebnisse ...........................................................................................46
6.1 Konjugation von Retinolsäure und einem monoklonalen Antikörper .... 46
6.2 In vitro-Testung der Konjugate ........................................................ 49
6.2.1 Konzentrationsbestimmung .........................................................49
6.2.2 Bindungsfähigkeit der Konjugate .................................................51
6.2.3 Beeinflussung des Zellwachstums ................................................53
6.3 Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Modells .................................... 55
6.4 Therapeutische Versuche / In vivo-Experimente................................ 58
6.4.1 Letale Dosis der all- trans-Retinolsäure .........................................58
6.4.2 Beeinflussung des Tumorwachstums durch Immunkonjugate ........59
6.4.3 Postmortale Untersuchung der Versuchstiere................................63
6.4.4 Beeinflussung der Überlebenszeit durch Immunkonjugate .............67
7 Diskussion............................................................................................68
7.1 Konjugation von Retinolsäure und einem monoklonalen Antikörper .... 68
7.2 In vitro-Testung der Konjugate ........................................................ 70
7.2.1 Konzentrationsbestimmung .........................................................70
7.2.2 Bindungsfähigkeit der Konjugate .................................................72
7.2.3 Beeinflussung des Zellwachstums ................................................73
7.3 Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Modells .................................... 75
7.4 In vivo-Experimente ........................................................................ 76
8 Schlußfolgerungen ................................................................................81
9 Literatur ..............................................................................................83
10 Abbildungsverzeichnis ...........................................................................92
11 Tabellenverzeichnis...............................................................................93
12 Anhang ..............................................................................................94
Abkürzungsverzeichnis 4
1 Abkürzungsverzeichnis
Ak Monoklonaler Antikörper
APAAP Alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase
BSA Bovines Serumalbumin
CRABP Cellular Retinoic Acid Binding Protein
DMSO Dimethylsulfoxid
EDC 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FKS Fötales Kälberserum
GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein
ICAM Intercellular Adhesion Molecule
IGF-R Insulin-like Growth Factor Receptor
MES 2-(N-Morpholino)-Ethan-Sulfonsäure
MTT-Test 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-Diphenyltetrazolium-Test
NCAM Neural Cell Adhesion Molecule
NF 68 Neurofilament 68
NGF-R Nerve Growth Factor Receptor
NSE Neuronenspezifische Enolase
PBS Phosphate Buffered Saline
PECAM Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule
RA all- trans-Retinolsäure
RAR Retinoic Acid Receptor
RXR Retinoid X Receptor
SCID Severe Combined Immunodeficiency
TGF-R Transforming Growth Factor Receptor
VIP Vasoaktives Intestinales Peptid
Zusammenfassung 5
2 Zusammenfassung
Das Neuroblastom ist das häufigste extrakranielle Malignom im Kindesalter. Die
Fünfjahresüberlebensrate beträgt bei kombinierter operativer, Radio- und
Chemotherapie 67 %. Vor allem jenseits des ersten Lebensjahres treten
Tumoren auf, die bereits bei Diagnosestellung weit fortgeschritten und trotz
intensiver Therapie mit einer ungünstigen Prognose verbunden sind.
Andererseits ist das Auftreten spontaner Regression über den Weg der
Ausdifferenzierung oder der Apoptose eine für das Neuroblastom typische
Eigenschaft. Seit 1982 ist bekannt, dass Retinolsäure, die sich bereits bei der
Therapie der promyelozytischen Leukämie bewährt hat, die Differenzierung von
Neuroblastomzellen und damit die Tumorregression bewirken kann.
In der vorliegenden Arbeit sollte durch die Kopplung von all- trans-Retinolsäure
an den monoklonalen anti-Neuroblastom-Antikörper 15/7 erreicht werden, dass
über dieses Immunkonjugat die Retinolsäure direkt an ihren Wirkort zur
Tumorzelle transportiert wird und somit effektiver und mit geringeren
unerwünschten Wirkungen auf gesundes Gewebe ihre Funktion als Differenzierungsinduktor
ausüben kann.
Die Kopplung erfolgte über die Carbodiimid-Methode mittels des Mediators
1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC). Nach Optimierung der
Kopplungsreaktion und der nachfolgenden Trennung der ungekoppelten
Retinolsäure vom Immunkonjugat konnte in einem Zell-ELISA gezeigt werden,
dass die Bindungsfähigkeit des Antikörpers an die Neuroblastomzelllinie
SK-N-MC durch die Kopplung nicht beeinträchtigt wird.
Im 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-Diphenyltetrazolium-Test (MTT-Test) fand sich
nach Inkubation von Kulturen der SK-N-MC-Zellen mit dem Immunkonjugat
eine signifikant verminderte Proliferation der Zellkultur (47 % proliferierende
Zellen) im Vergleich zur ungekoppelten Retinolsäure (RA, 80 %)
Zusammenfassung 6
oder dem Antikörper allein (Ak, 89 %) sowie dem Gemisch beider Substanzen
(Ak+RA, 79 %), wie auch zum Zellkulturmedium (100 %) und dem als
Lösungsmittel der Retinolsäure dienenden Ethanol (100 %).
Um die wachstumshemmende und differenzierungsfördernde Wirkung des
Immunkonjugates auch in vivo untersuchen zu können, wurde ein SCID-Maus-
Tumormodell etabliert, das dem natürlichen Phänomen der Metastasierung
möglichst nahekommt. Zu diesem Zweck wurden sechs bis acht Wochen alten
SCID-Mäusen jeweils 2 x 107 Zellen der permanenten Neuroblastomzelllinie
SK-N-MC zur Hälfte intravenös und intraperitoneal injiziert.
Beginnend am zweiten bis dritten Tag nach Tumorzellapplikation wurden den
Versuchstieren die Immunkonjugatlösung sowie die Kontrolllösungen (RA, Ak,
Ak+RA, NaCl) insgesamt sechsmal im Abstand von zwei bis drei Tagen
intraperitoneal appliziert. Die Tumormasse je Versuchstier war am niedrigsten
nach Konjugatapplikation (0,32 g), signifikant erniedrigt gegenüber RA (1,66 g)
jedoch nicht gegenüber Ak+RA (1,50 g), Ak (1,71 g), oder NaCl (1,79 g). Die
Tumorzahl je Versuchstier nach Konjugatapplikation (3,5) war niedriger als
nach Behandlung mit den einzelnen Substanzen RA (6,0), Ak (5,0) oder NaCl
(6,0) und geringfügig größer als nach Behandlung mit Ak+RA (3,0), wobei
signifikante Unterschiede gegenüber NaCl und RA auftraten. Das Überleben der
Versuchstiere konnte durch die Behandlung mit dem Immunkonjugat nicht
verlängert werden.
Für eine stärkere Zelldifferenzierung der konjugatbehandelten Tumoren im
Vergleich zu kochsalzbehandelten Tumoren sprach im immunzytologischen
alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase-Test (APAAP-Test) die
vermehrte Nachweisbarkeit der für die Differenzierung relevanten Adhäsionsmoleküle
ICAM und NCAM, des Wachstumsfaktorrezeptors TGF-R und des
Schwannzellmarkers GFAP sowie in der Histochemie der stärkere Nachweis der
Schwannzellmarker GFAP und S100 sowie des für Neuronen spezifischen
Intermediärfilaments Alpha1-Internexin.
Zusammenfassung 7
Die Kopplung von all- trans-Retinolsäure an den monoklonalen Antikörper 15/7
gelang erfolgreich. Die Funktionalität des Antikörpers wurde dadurch nicht
beeinträchtigt. Das Wachstum einer Neuroblastom-Zellkultur konnte eindrucksvoll
gehemmt werden. In vivo-Tests ergaben die niedrigste Tumormasse und
eine stärkere Reifung der Tumorzellen nach Konjugatbehandlung. Die Überlebensdauer
konnte durch die Konjugatbehandlung nicht signifikant verbessert
werden.
Die vielversprechenden Ergebnisse insbesondere der in vitro-Versuche
rechtfertigen weitere Optimierungsschritte auf dem Weg zum klinischen Einsatz
des Immunkonjugates.
Einleitung 8
3 Einleitung
3.1 Neuroblastom
Vielfältigste Faktoren steuern Wachstum und Differenzierung unserer Körperzellen.
Dazu zählen unter anderem genetische Informationen. Sind sie fehlerhaft,
kann die für eine maligne Erkrankung typische unkontrollierte Zellteilung
in Gang kommen. Bei Kindern stehen Malignome als Todesursache nach
Unfällen an zweiter Stelle. Von 100 000 Kindern unter 15 Jahren erkranken
jährlich -13 bis 14 an Krebs. Die Heilungsrate insgesamt beträgt bei Kindern
etwa 70 % (Schön et al., 1999).
Das histopathologische Erscheinungsbild des Neuroblastoms wurde erstmals
1864 durch R. L. K. Virchow beschrieben und der Begriff Neuroblastom 1910
von J. H. Wright geprägt (Evans, 2000).
Das Neuroblastom ist nach Leukämien und bösartigen Hirntumoren die
dritthäufigste maligne Erkrankung bei Kindern (Matthay, 1995) und in dieser
Altersgruppe für 8 % der Krebserkrankungen (Mora et al., 2001) und für 15 %
der Krebstodesfälle verantwortlich (Matthay, 1997). Insgesamt konnte in den
vergangenen zwanzig Jahren das Fünfjahresüberleben von Kindern mit einem
Neuroblastom von 48 % auf 67 % angehoben werden (Berthold und Hero,
2000).
Das mediane Alter bei Diagnosestellung ist der 22. Lebensmonat (Castleberry,
1997). Vor dem fünften Lebensjahr werden bereits 90 % aller Neuroblastome
diagnostiziert. Der Primärtumor ist in 65 % der Fälle ein abdomineller Tumor.
Die hämatogene Ausbreitung kann in das Knochenmark, in das Skelettsystem,
Leber, Haut, seltener in die Lungen oder das Gehirn erfolgen.
Die Ätiologie des Neuroblastoms ist letztendlich unklar. Es wird als embryonaler
Tumor angesehen, der sich während des fetalen oder frühen postnatalen
Lebens aus Zellen der Neuralleiste entwickelt, die noch unreif oder
dedifferenziert sind (Mora et al., 2001).
Einleitung 9
Es gibt zumindest drei klinische Muster des Neuroblastoms. Diese sind die
disseminierte Erkrankung, die ohne medizinische Intervention spontan
zurückgehen kann (International Neuroblastoma Staging System INSS Stadium
4S), der örtlich begrenzte Tumor, der lokal rezidivieren kann aber nicht in
Knochen oder Knochenmark metastasiert (INSS Stadium 1, 2, 3) und die
metastasierte Erkrankung, die auf eine zytostatische Therapie anspricht aber
häufig mit letalen Komplikationen wiederkehrt (INSS Stadium 4). Bei Diagnosestellung
befinden sich über 50 % der Patienten im Stadium 4, das Überleben
liegt dann bei Patienten über einem Jahr um 20 % (Mora et al., 2001).
Die Einteilung der Neuroblastomerkrankungen in Therapiegruppen erfolgt nach
den biologischen Merkmalen Alter bei Diagnose, klinisches Stadium, Status der
MYCN-Amplifikation, histopathologischer Befund und DNA-Ploidität. In erster
Linie aus Alter bei Diagnose, MYCN-Status und INSS-Stadium resultieren die
Risikogruppen Beobachtungspatienten, Standardrisikopatienten und Hochrisikopatienten.
Bei niedrigem Risiko ist es das Ziel, die für eine Langzeitheilung
erforderliche Therapie so weit wie möglich zu reduzieren, um unerwünschte
Nebenwirkungen der Therapie und Langzeitfolgen möglichst gering zu halten.
Bei hohem Risiko wird nach einer Hochdosischemotherapie eine Stammzelltransplantation
durchgeführt. In dieser Gruppe befinden sich nach fünf Jahren
25-40 % der Patienten in kompletter Remission.
Mittlerweile wird in neuen Therapieempfehlungen der Einsatz der 13- cis-Retinolsäure
bei Residualtumorzellbefall nach intensiver Therapie und zur Konsolidierungstherapie
empfohlen. Studienergebnisse zeigten einen Anstieg des ereignisfreien
Überlebens nach drei Jahren durch die Therapie mit 13- cis-Retinolsäure
nach initialer Chemo- und Radiotherapie und anschließender Knochenmarktransplantation
oder nach Chemotherapie von 29 % auf 46 %. Die deutlichsten
Erfolge mit 13- cis-Retinolsäure konnten bei minimaler Restkrankheit (MRD,
minimal residual disease) mit kompletter Remission nach initialer Chemotherapie
erzielt werden (Matthay et al., 1999).
Aufgrund ihres aggressiven Verhaltens besitzen 60 % der
Neuroblastomerkrankungen eine schlechte Prognose. Typisch für die übrigen
40 %, in denen das klinische Verhalten des Tumors günstiger ist, sind
Involution, spontane Regression oder Maturation des Tumors.
Einleitung 10
Die biologisch günstigeren Tumoren treten meist im Laufe des ersten
Lebensjahres auf, so dass inzwischen von mindestens zwei differenten
biologischen Untergruppen von Neuroblastomen ausgegangen wird, für die
verschiedene genetische und molekulare Marker existieren. Tumorsuppressorgene
wurden zum Beispiel auf den Chromosomen 1 und 17 gefunden, bei
vermehrtem Vorhandensein dieser genetischen Information im Sinne einer
Hyperploidie der DNA resultiert bei jüngeren Kindern eine günstigere Prognose.
Ein zuverlässiger Marker aggressiven klinischen Verhaltens ist die genomische
Amplifikation und dadurch Aktivierung des MYCN-Proto-Onkogens, die bei 20
bis 25 % der Neuroblastome zu finden ist (Maris, Matthay, 1999). Eine
vermehrte Expression des NGF-Rezeptors (Nerve Growth Factor Receptor)
hingegen wird bei klinisch günstigeren Verläufen gefunden.
Beim Neuroblastom sind einige biochemische Marker in Serum und Urin
charakteristischerweise erhöht. Dazu zählen unter anderem die Katecholaminmetaboliten
Homovanillinmandelsäure (HVA) und Vanillinmandelsäure (VMA),
das Neuro-peptid Y, das vasoaktive intestinale Peptid, die neuronenspezifische
Enolase und Ferritin.
Da der Tumor zwar insgesamt selten aber unter Säuglingen die häufigste
maligne Erkrankung ist, liegt die Frage nach einer Möglichkeit der
Früherkennung auf der Hand. Bei dem auf der Grundlage der Bestimmung von
HVA und VMA im Urin vielerorts durchgeführten Screening bei Säuglingen im
Alter von bis zu einem Jahr wurden Tumoren mit meist günstigen Eigenschaften
entdeckt. Da jedoch die Prävalenz des Neuroblastoms in der gescreenten
Population nahezu zweimal so hoch wie die der ungescreenten Population war,
wurden offenbar auch Tumoren erfaßt, die sonst einer spontanen Regression
verfallen wären. Da zum Zeitpunkt der Diagnosestellung zwischen einem
günstigen und potentiell lebensbedrohlichen Verlauf nicht unterschieden
werden konnte, ist die Folge automatisch eine Übertherapie. Ein generelles
Screening wird aus diesen Gründen zur Zeit nicht unterstützt (Shimada,
Nakagawa, 1999; Schilling et al., 2002).
Trotz häufiger dramatischer Verläufe hat das Neuroblastom die höchste Rate
spontaner Regression unter allen Tumoren und kann selbst bei Metastasierung
zu einem gutartigen Ganglioneurom reifen.
Einleitung 11
Ein sogenanntes Neuroblastoma in situ, also eine (noch) nicht invasive Form,
wird unabhängig von der Todesursache bei Obduktionen vierzigmal häufiger
gefunden als ein klinisch detektierbarer Tumor. Seitdem dieses Wissen bekannt
wurde, konnten bei nahezu allen verstorbenen Feten Foci derartiger Zellreste
nachgewiesen werden (Castleberry, 1997). Als einer der potentesten
Induktoren für Reifung und Differenzierung bis zu einem Ganglioneurom wurde
in vitro die Retinolsäure (RA) beschrieben (Reynolds et al., 1991). Das Ganglioneurom
bezeichnet neben Neuroblastom, Ganglioneuroblastom und nodulärem
Ganglioneuroblastom eine der vier Kategorien, in die neuroblastische Tumoren
histopathologisch eingeteilt werden können. Als Zeichen der Maturierung ist
eine Zunahme des Anteils der Schwannzellen typisch (Shimada et al., 1999b).
Der immunhistochemische Nachweis der Oberflächenantigene GFAP und S100
ist ein Weg Schwannzellen zu charakterisieren.
Eine weitere Möglichkeit, den Reifegrad eines Neuroblastoms zu beschreiben,
ist der Nachweis zellulärer Adhäsionsmoleküle (Cellular Adhesion Molecules
CAM). Sie sind in die Zelladhäsion und Immunerkennung involviert und werden
auf der Oberfläche von Neuroblastomzellen exprimiert. Bei Neuroblastomen
niedrigeren Stadiums oder höherer Differenzierung wird die Expression
verschiedener CAMs hochreguliert, insbesondere Intercellular Adhesion
Molecule (ICAM-1) (Gross et al., 1992). Der Nachweis der Expression geschieht
zum Beispiel über die alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase-
Technik (APAAP-Technik). Sie ist eine etablierte Methode bei der Färbung
humaner Gewebeantigene (Cordell et al., 1984). Dass die Expression einzelner
Adhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktorrezeptoren auf der Zelloberfläche von
Neuroblastomzellen der Linie SK-N-MC nach Inkubation mit all- trans-
Retinolsäure deutlich ansteigt, wurde für ICAM, NCAM, PECAM, VCAM und
IGF-R gezeigt. Ebenfalls vermehrt exprimiert war NF68, während die Expression
von NGF und TGF-R etwa unverändert blieb (Voigt et al., 2000).
Einleitung 12
3.2 Retinolsäure
Seit Beginn des 19. Jahrhunderts war Vitamin A als ein wichtiger
Nahrungsbestandteil und seine bedeutsame Rolle beim Sehzyklus bekannt. Bei
einem Vitamin A-Mangel in der Schwangerschaft wurden Fehlbildungen
beobachtet. Da diese Fehlbildungen durch Gabe von Retinolsäure verhindert
werden konnten, wurde Retinolsäure als die biologisch aktive Form des
Vitamin A angenommen (Rohwedel et al., 1999). Als solche ist sie für die
Vermittlung und Aufrechterhaltung zellulärer Differenzierung erforderlich. Bei
Säugetieren kommen endogen sowohl all- trans- als auch 13- cis-Retinolsäure
vor (Blaner, 1993).
Von Petkovich et. al und von Giguere et al. wurde 1987 der erste
Retinoidrezeptor beschrieben, der heute als Retinoic Acid Receptor alpha (RARalpha)
bekannt ist. Inzwischen wurden sechs weitere gut beschrieben, die
entweder all- trans-Retinolsäure oder deren Metaboliten 9- cis-Retinolsäure
binden und über ein kompliziertes Wirkungsmuster zur Kontrolle spezifischer
Genexpression verfügen.
Retinolsäurerezeptoren als hochaffine ligandinduzierte Transkriptionsfaktoren
gehören wie Steroid- und Schilddrüsenhormonrezeptoren zur Superfamilie der
nukleären Hormonrezeptoren (Noy, 2000). Es werden die Retinolsäurerezeptoren
RAR alpha, beta, gamma und Retinoid X Receptor (RXR) alpha, beta
und gamma unterschieden. RAR binden all- trans-Retinolsäure mit hoher
Affinität, 9- cis-Retinolsäure wird sowohl von RAR als auch von RXR gebunden.
Wie andere Mitglieder der Steroidhormonrezeptorfamilie verfügen RAR und RXR
über eine ligandbindende und eine DNA-bindende Domäne. Nachdem
Retinolsäure an den nukleären Rezeptor gebunden ist, bilden sich homo- oder
heterodimere Komplexe (Evans, Kaye, 1999). Diese Komplexe binden an
sogenannte Retinoid Response Elements RARE in der Promotorregion des
Targetgens, was eine höhere oder niedrigere Transkription zur Folge hat
(Hansen et al., 2000). RAR und RXR spielen im Signalweg verschiedene Rollen,
die Genexpression nach Einwirkung von 9- cis- und all- trans-Retinolsäure führte
in vitro zu verschiedenen Resultaten (Lovat et al., 2001).
Einleitung 13
Die Aktivierung der Retinolsäurerezeptoren kann zu einer Hemmung der
Zellproliferation führen und Differenzierung oder Apoptose induzieren. Diese
Vorgänge wurden in mesenchymalen, neuroektodermalen, hämatopoetischen
und epithelialen Zellen sowohl während der normalen Entwicklung als auch in
normalen und transformierten Zellen in der Zellkultur beobachtet. Synthetische
neue Retinoide sind zum Beispiel 4HPR, der RAR-selektive Ligand ALRT1550
und der RXR-selektive Ligand LGD1069. Mittels dieser Substanzen könnten die
Signalwege genauer indentifiziert werden und sich neue therapeutische
Möglichkeiten eröffnen (Evans, Kaye, 1999).
In vivo kommt Retinolsäure entweder gebunden an Zellmembranen oder an
speziellen retinoidbindenden Proteinen vor und wird vermutlich durch zelluläre
retinoidbindende Proteine in den Zellkern transportiert. Die intrazellulär und im
Nukleus vorkommenden Moleküle Cellular Retinoic Acid Binding Protein CRABP-I
und -II lösen und stabilisieren ihre hydrophoben und labilen Liganden im
wäßrigen Raum. Ihre Funktion ist wahrscheinlich nicht nur die Bindung sondern
auch die Regulation von Transport, Metabolismus und Wirkung der
Retinolsäure. Es wurde beschrieben, dass CRABP-I die Aktivität von Enzymen
moduliert, die die metabolische Transformation von Retinolsäure katalysieren.
CRABP-I scheint die zelluläre Reaktion auf Retinolsäure abzudämpfen. CRABP-II
transportiert Retinolsäure direkt an RAR. Die Expression von CRABP-II scheint
Zellen auf Retinolsäure zu sensibilisieren (Noy, 2000). CRABP-I und II sind hoch
konservierte Moleküle. Bei einem übermäßigen Angebot an Retinolsäure wurden
Embryopathien beobachtet, es traten Fehlbildungen der Neuralrohrstrukturen,
Herzfehler und Thymusabnormalitäten auf. Dass in Tiermodellen sehr ähnliche
Muster auftraten, verdeutlicht den essentiellen und bedeutenden Mechanismus
in der Entwicklung (Berry, 1997).
Retinoide erfordern eine spezielle Handhabung, Aufbewahrung und Analyse. Die
natürlich vorkommenden Retinoide besitzen fünf oder mehr konjugierte Doppelbindungen
und werden so durch Luftsauerstoff leicht angegriffen, durch Licht
isomerisiert sowie durch Hitze in biologisch weniger oder inaktive Komponenten
umgesetzt.
Einleitung 14
All- trans-Retinolsäure (C20H28O2) hat ein Molekulargewicht von 300,4 g/mol. Sie
ist extrem empfindlich gegenüber ultravioletter Strahlung, Luft und
oxidierenden Substanzen.
Unter Lichteinwirkung kommt es zu einer Photoisomerisation, die umso
ausgeprägter ist, je niedriger die Konzentration der Retinolsäurelösung ist. In
einer 10-5 M Lösung betrug die Photoisomerisation nach 30 min 100 %. Der
biologische Effekt der Isomerisation zu 9- cis-, 11- cis-, 13- cis- und 9,13-di- cis-
Retinolsäure wurde an embryonalen Karzinomzellen untersucht. Im Vergleich zu
all- trans-Retinolsäure lag die Aktivität, die Differenzierung von Karzinomzellen
zu induzieren, von 9- cis-, 11- cis- und 13- cis-Retinolsäure bei 1/10, die der 9,13-
di- cis-Retinolsäure bei 1/100 (Murayama et al., 1997).
Retinolsäure ist in Wasser praktisch nicht sondern nur in organischen
Lösungsmitteln löslich. In DMSO ist Retinolsäure bis 40 mg/ml löslich, in
95%igem Ethanol bis 2,7 mg/ml. Eine Vorratslösung von 0,01 M Retinolsäure
(3 mg/ml) in absolutem Ethanol kann bis zu zwei Wochen bei –70 °C
aufbewahrt werden (Sigma Product Information Sheet).
Die maximale Lichtabsorption von in Ethanol gelöster all- trans-Retinolsäure liegt
bei 340 nm. Die Absorptionsspektroskopie ist eine gute Methode zur
Quantifizierung von Retinolsäure-Konzentrationen in Lösungen.
Retinoide sind erstklassige Kandidaten für die Chemoprävention von Krebs, da
sie Zellproliferation und -differenzierung regulieren und Krebs mit einem
gestörten Wachstum und einem Verlust der Differenzierung verbunden ist
(Moon et al., 1994).
Bei der Regeneration von Nerven spielt Retinolsäure eine Rolle als
Transkriptionsregulator. Gliazellen produzieren Retinolsäure, diese interagiert
mit Zytokinsignalen, die zelluläre Interaktionen nach einer Nervenläsion
vermitteln. In vitro konnte gezeigt werden, wie Retinolsäure die axonale
Regeneration verstärkt. Während der Entwicklung werden gliale und neuronale
Differenzierung durch endogene Retinolsäure gefördert (Mey, 2001).
Eine verstärkte Aufnahme von Retinol (Vitamin A) über die Nahrung erhöht
jedoch nicht die Retinolsäurekonzentration im Organismus sondern führt zur
Ansammlung von Retinylestern in der Leber. Deshalb ist die direkte Zufuhr von
Retinolsäure für therapeutische und Präventionszwecke erforderlich.
Einleitung 15
Bei Vitamin A-defizienten Tieren bewirkte die Substitution mit Retinolsäure eine
Hautkrebsprävention (Hansen et al., 2000). In klinischen Studien zeigte
Retinolsäure nicht nur eine Wirkung bei der Unterdrückung präkanzeröser
Läsionen der Haut sondern inhibierte auch sekundäre Hautkrebsentstehung bei
Xeroderma pigmentosum sowie nach operativer oder Radiotherapie von
Karzinomen im Kopf- und Halsbereich (Lippman, Lotan, 2000).
Retinoide verhielten sich bei Mammakarzinomen synergistisch mit Tamoxifen als
Inhibitoren des Wachstums von östrogenrezeptorpositiven Zellen (Yang et al.,
1999) und erreichen bei der akuten promyelozytischen Leukämie (APL) in
Kombination mit Chemotherapie ein besseres Überleben (Fenaux et al., 2001).
In vitro wurde 1982 erstmals die Differenzierung von Neuroblastomzellen durch
Retinolsäure gezeigt (Sidell, 1982). Bei manchen Neuroblastomzellen zeigen
sich nach Einwirkung von all- trans-, 9- cis- oder 13- cis-Retinolsäure tiefgreifende
morphologische Veränderungen wie ausgeprägte Neuritenbildung und
reduziertes Zellwachstum. Gleichzeitig wird die Synthese von neurospezifischen
Enzymen wie Acetylcholinesterase und von Neurotransmittern wie Katecholaminen
erhöht. Die Expression entsprechender Zelladhäsionsmoleküle (CAM),
die bei Zell-Zell-Interaktionen während Wachstum und Differenzierung eine
Rolle spielen, verändert sich ebenfalls (Voigt et al., 2000).
Es wurden multiple unerwünschte Arzneimittelwirkungen der Retinolsäure
beschrieben. Dosislimitierend waren unter anderem Hyperkalzämie, Exantheme,
Übelkeit, Anämie, Thrombozytopenie, die nach Beendingung der Therapie
sistierten. Mit 58–89 % erlebten die meisten Patienten eine gewisse
Hauttoxizität. Dazu zählen trockene oder schuppende Haut, Cheilitis,
Konjunktivitis und erythematöse makulopapulöse bis bullöse Effloreszenzen.
Gastrointestinale Symptome wie Diarrhoe, Erbrechen, Übelkeit, Bauchschmerzen
und Anorexie traten ebenfalls auf (Villablanca et al., 1995).
Pseudotumor cerebri wurde vor allem bei pädiatrischen Patienten beobachtet.
All- trans-Retinolsäure wirkt darüberhinaus stark teratogen (Dimery, 1993).
Einleitung 16
3.3 Monoklonale Antikörper
Antikörper sind Proteine, die mit ihren Antigenbindungsstellen eine spezifische
Bindung mit Zielstrukturen, den Epitopen, eingehen können. Die Bildung und
Freisetzung von Antikörpern erfolgt durch Plasmazellen, die aus B-Lymphozyten
hervorgehen. Antikörper sind aus einem variablen Fab-Teil und einem
konstanten Fc-Teil aufgebaut. Die Eigenschaft eines Antikörpers, an spezifische
Epitope zu binden, wird durch die unterschiedlichen Aminosäuresequenzen im
variablen Anteil realisiert. Für den Fc-Teil besitzen andererseits viele Zellen
Rezeptoren, worüber die Effektorfunktion des Antikörpers vermittelt wird.
Monoklonale Antikörper sind uniforme Immunglobulinmoleküle, die von einem
einzigen B-Zell-Klon abstammen und denselben Antigenbereich erkennen
(Nelson et al., 2000). Deren Herstellung für den umfangreichen Einsatz in Klinik
und Forschung ist möglich seit der Einführung der Hybridomtechnik durch
Köhler und Milstein (1975). Dazu werden Mäuse mit dem entsprechenden
Antigen immunisiert und die entstandenen B-Zellen isoliert. Diese
B-Lymphozyten werden durch Fusionierung mit Kulturlinien von Myelomzellen
unsterblich und produzieren langfristig den jeweiligen monoklonalen Antikörper.
Inzwischen können monoklonale Antikörper auch durch rekombinante
Produktion mittels Phagen gewonnen werden (Breedveld, 2000).
Diagnostisch können monoklonale Antikörper in der Onkologie eingesetzt
werden, um Gewebe und Tumoren histopathologisch zu klassifizieren und um
Tumormarker nachzuweisen und dadurch zum Beispiel die Prognose
abzuschätzen (Nelson et al., 2000).
Eine Möglichkeit der therapeutischen Anwendung monoklonaler Antikörper ist
die Inhibierung allo- und autoimmuner Reaktivität. Der Anti-CD3-Antikörper
Muromonab wird zur Prävention der Transplantatabstoßung nach
Nierentransplantation genutzt. Infliximab, ein anti-TNF-Antikörper, wird bei
ausgeprägten Verlaufsformen von Morbus Crohn und Rheumatoidarthritis
eingesetzt. In Studien wurde Abciximab als Inhibitor der Plättchenaggregation
untersucht. Palivizumab wird in der Prophylaxe der Infektion mit RSV, dem
Respiratory Syncytial Virus, bei Kindern mit definierten Risikofaktoren
angewandt (Breedveld, 2000).
Einleitung 17
Die Immuntherapie ist mittlerweile eine vierte Therapiemodalität in der
Onkologie neben operativer, Radio- und Chemotherapie. Durch die hochspezifische
Bindung besteht dabei ein recht großes potentielles therapeutisches
Fenster mit maximalen Antitumoreffekten und limitierter Toxizität für den Wirt.
Die Unterschiede zwischen Antigenen auf Tumorzellen und normalen Zellen sind
dabei eher quantitativer als qualitativer Art. Der ideale spezifische Antikörper
sollte alle Tumorlokalisationen erreichen, einschließlich der Metastasen, ohne
die große Masse der wachsenden und sich differenzierenden normalen Zellen
anzugreifen (Bodey et al., 2000). Antikörper können dabei genutzt werden für
die direkte Modulation der Tumorfunktion, zur Förderung der Tumorlyse durch
Immuneffektorzellen und als regelrechte „Geschosse“ (magic bullets) beladen
mit Radionukliden, Toxinen oder Chemotherapeutika.
Rituximab als nichtkonjugierter monoklonaler Antikörper wird zum Beispiel beim
Non-Hodgin-Lymphom mit dem Ziel eingesetzt, eine biologische Antitumorantwort
auszulösen. Anfang des Jahres 2002 wurde Zevalin, ein radionuklidgebundener
monoklonaler Antikörper, für die Therapie von Non-Hodgin-
Lymphomen zugelassen (Gura, 2002). Außerdem wird die Einsatzmöglichkeit
von monoklonalen Antikörpern bei der Therapie von Melanomen, Brustkrebs
und Kolonkarzinomen untersucht.
Das Gangliosid GD2 ist ein Antigen, das auf der Oberfläche humaner
Neuroblastomzellen stark exprimiert ist. Monoklonale Anti-GD2-Antikörper
werden in der Neuroblastomtherapie eingesetzt. Einer dieser Antikörper,
ch14.18, ist ein chimeres Konstrukt, das heißt, er besitzt murine variable
Regionen und humane konstante Regionen. Dadurch sind die antigenbindenden
Eigenschaften vergleichbar zu murinen monoklonalen Antikörpern und die
physikalischen und komplement- und Fc-Rezeptorbindenden Eigenschaften
vergleichbar denen humaner Immunglobulinketten. Seine Verträglichkeit wurde
in einer Phase-I-Studie bei minimaler Restkrankheit nach Neuroblastomtherapie
gezeigt (Ozkaynak et al., 2000). Für murine monoklonale Antikörper wie 14G2a
konnte in Phase-I- und -II-Studien die Fähigkeit, Tumorzellen im Knochenmark
abzutöten, demonstriert werden. Die Wirkung auf eine größere Tumormasse
war weniger deutlich (Brodeur, 2000).
Einleitung 18
Für zielspezifische zytotoxische Prozesse werden mittlerweile Immunkonjugate
untersucht. Dazu werden Antikörper gekoppelt an hochletale Zellgifte wie das
Pflanzengift Ricin und das bakteriell abgeleitete Pseudomonasexotoxin,
außerdem an konventionelle Chemotherapeutika wie Doxorubicin oder
Calicheamicin oder an Radionuklide wie Jod 131 oder Yttrium 90 (Weiner,
1999). Konkrete Studien wurden bereits bei malignen Melanomen, Pankreaskarzinom,
Kolonkarzinom und ALL mit Ricin A-gekoppelten monoklonalen
Antikörpern durchgeführt, außerdem mit pseudomonastoxingekoppelten
Antikörpern bei Adulter T-Zell-Leukämie.
Ein muriner monoklonaler Antikörper, der unter anderem die Neuroblastomzellinie
SK-N-MC spezifisch erkennt, ist der Antikörper 15/7. Er konnte nach der
Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit einer Mischung der humanen
Neuroblastomzelllinien CHP 134, SK-N-FI, SK-N-AS, SK-N-LO, SK-N-MC, SK-PNDW
und IMR 5 isoliert und mittels der Hybridomtechnik produziert werden. Der
monoklonale Antikörper 15/7 gehört der Immunglobulinsubklasse IgG2b an.
Seine Bindungsrate an Tumorzellen der Linie SK-N-MC lag bei 90 %. Sowohl zu
den meisten Organen und Geweben als auch zu anderen malignen Tumoren
wurde keine Kreuzreaktivität gefunden. Lediglich Perineurium und interstitielles
Bindegewebe zeigten ebenfalls eine deutliche Reaktion (Voigt et al., 1993).
Jod 131 wurde an den monoklonalen Antikörper 15/7 gekoppelt und die
Verteilung in neuroblastomtragenden SCID-Mäusen untersucht. Die Tumoren
aus SK-N-MC-Zellen wuchsen subkutan, der radioaktiv markierte Antikörper
wurde intraperitoneal injiziert. Im Vergleich zu anderen Geweben war die
Anreicherung des Antikörpers im Tumor 9,5fach (Voigt et al., 1997).
Trotz potentieller Einsatzmöglichkeiten in Diagnostik und Therapie gibt es bei
der Therapie mit monoklonalen Antikörpern Hindernisse. Der Antikörper gelangt
nur begrenzt an den Tumor und wird im Tumorgewebe nicht immer homogen
verteilt. Darüberhinaus können zytotoxische und immunmodulatorische Zellen
oft nicht den kompletten Tumor durchdringen. Nicht nur in der Zellkultur, auch
in vivo besitzt die Oberfläche der Tumorzellen eine deutliche Antigenheterogenität.
Nicht zuletzt ist Tumortherapie mit murinen monoklonalen
Antikörpern limitiert durch die Induktion von humanen Anti-Maus-Antikörpern
(Weiner, 1999).
Einleitung 19
Zur Kopplung von Retinolsäure an den monoklonalen Antikörper 15/7 wurde
EDC benutzt. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (hier in Form von
C8H17N3 x HCl = Carbodiimidhydrochlorid eingesetzt) ist ein wasserlösliches
Derivat von Carbodiimid.
Carbodiimid katalysiert die Bildung einer Amidbindung zwischen Carboxylsäuren
(hier Retinolsäure) oder Phosphaten und Aminen (hier Antikörper als Protein)
durch Aktivierung von Carboxylgruppen oder Phosphaten zur Bildung von
O-N-Derivaten. Diese Derivate reagieren bereitwillig mit nukleophilen
Substanzen. Carbodiimid kann genutzt werden zur Bildung von Etherbindungen
von Alkoholgruppen und Esterbindungen von Säuren und Alkoholen oder
Phenolen sowie zur Bildung von Peptidbindungen zwischen Säuren und Aminen.
Carbodiimid wird oft für die Peptidsynthese genutzt als wasserlösliches Derivat
EDC oder als in organischen Lösungsmitteln lösliches Derivat N,N‘-dicyclohexylcarbodiimid
(DCC). Außerdem ist die EDC-Kopplung eine etablierte Methode in
der Synthese von Biomaterialien. So machen Kollagen-Glykosaminoglykane, die
durch EDC-Kopplung vernetzt wurden, Studien zur Herstellung künstlichen
Gelenkknorpels möglich (Lee et al., 2001). Die Kreuzvernetzung von Kollagen
und Elastin verbesserte die Resistenz der so entstandenen Matrix gegenüber
enzymatischem Abbau, die als Komponente artifiziellen Hautersatzes einsetzbar
sein könnte (Hafemann et al., 2001).
Eine weitere Einsatzmöglichkeit der EDC-Kopplung in der Synthese von
Biomaterialien sind Dacron-Gefäßprothesen, an deren Oberfläche kovalent über
EDC-Kopplung rekombinantes Hirudin gebunden wurde, um die Thrombogenität
der Oberfläche zu senken und das Entstehen einer zellulären Neointima zu
fördern (Wyers et al., 1999).
Darüberhinaus spielt die EDC-Kopplung eine wichtige Rolle in der Impfstoffentwicklung.
Die Kopplung von Pertussistoxin und filamentösem Hämagglutinin,
einem ausgesprochen immunogenem Bestandteil von Bordetella pertussis,
erbrachte einen Impfstoff, der im Tierversuch erfolgreicher protektive
Immunität erzielte als die formalinbehandelte Vakzine (Watanabe et al., 2000).
Im Falle der Kopplung von Retinolsäure an den monoklonalen Antikörper 15/7
reagierte EDC zunächst mit der Carboxylgruppe an der Retinolsäure oder am
Antikörper unter Bildung eines reaktiven O-acyl-Harnstoffderivats.
Einleitung 20
An der Carboxylgruppe, die dadurch aktiviert wurde, entstand durch
Ankopplung des Antikörpers über eine primäre Aminogruppe eine Peptidbindung.
Der Mediator EDC wurde als wasserlösliches Harnstoffderivat
freigesetzt. Die Hydrolyse des EDC-Intermediats ist dabei die bestimmende
Reaktion während der Kopplung, abhängig von Temperatur, pH und
Pufferkonzentration.
3.4 In vivo-Tumormodelle
SCID-Mäuse sind geeignete Wirtstiere für eine Vielzahl von humanen Tumoren.
Sie machen Studien an disseminierten Tumoren möglich, die in anderen
Tumormausmodellen wie zum Beispiel der thymuslosen Nacktmaus deutlich
schwieriger zu realisieren sind (Mueller, Reisfeld, 1991). Untersuchungen an
disseminierten Tumoren sollen eine Annäherung an die Metastasierung
humaner Malignome sein. Durch die systemische Applikation von Tumorzellen
mit dem Ziel eines Anwachsens an möglichst vielen Stellen im Organismus wird
die Streuung von einem primären Tumorherd aus simuliert, wie sie
natürlicherweise im Rahmen maligner Erkrankungen vorkommt.
Das Severe Combined Immunodeficiency Syndrome (SCID) ist die
folgenschwerste Erkrankung des menschlichen lymphatischen Systems. Diese
Mutation bei Mäusen wurde erstmals 1983 von Bosma et al. beschrieben. Diese
Mäuse hatten eine defiziente Funktion sowohl der T- als auch der
B-Lymphozyten. Sie bildeten kaum Immunglobuline. Kutane Allotransplantate
wurden nicht abgestoßen, was das dramatischste Zeichen für die T-Zell-
Defizienz darstellte.
SCID-Mäuse entstanden initial durch eine Punktmutation auf Chromosom 16
(Bosma et al., 1989). Durch eine DNA-Reparatur-Störung ist die Reifung der
Lymphozyten unterbrochen und ein Defizit an zirkulierenden, maturen,
funktionellen T- und B-Zellen entstanden. Dabei ist die Zahl und Funktion der
Monozyten / Makrophagen, natürlichen Killerzellen und Granulozyten normal.
Die Host-versus-graft-disease, also Wirt-gegen-Spender-Krankheit, kann von
Einleitung 21
Maus zu Maus beträchtlich variieren. Sie wurde ebenfalls als abhängig von dem
für die Übertragung benutzten histologischen Tumortyp beschrieben.
Sowohl für murine Granulozyten, Makrophagen als auch natürliche Killerzellen
wurde gezeigt, dass sie dazu beitragen, das Angehen des Tumorzell-
Engraftments zu hemmen.
An SCID-Mäusen wurden bereits mehrere Therapiemodalitäten gegen Krebs
getestet. Was die antikörperbasierte Therapie anbelangt, so ist bekannt, dass
für den Antitumoreffekt die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität
verantwortlich ist. Sie wird durch residente Wirtszellen vermittelt. SCID-Maus-
Modelle wurden wirkungsvoll angewandt, um neue Chemotherapeutika und ihre
Verabreichungsmöglichkeiten zu evaluieren. Die Ergebnisse solcher Studien
deuten an, dass Daten aus SCID-Maus-Modellen gut mit Beobachtungen bei
Krebspatienten korrelieren (Bankert et al., 2001).
Das gute Angehen der hier benutzten SK-N-MC-Zellen in der SCID-Maus bei
subkutaner Injektion wurde in Vorversuchen beobachtet, wo die Rate des
Anwachsens bei etwa 75 % lag (Voigt et al., 1997).
Ziele der Arbeit 22
4 Ziele der Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, auf experimentellem Wege eine neue Möglichkeit der
Neuroblastomtherapie zu untersuchen. Im Mittelpunkt stand die Frage, ob
Immunkonjugate aus all- trans-Retinolsäure und dem monoklonalen Anti-
Neuroblastom-Antikörper 15/7 einen Weg zur Verbesserung der Therapie des
Neuroblastoms darstellen könnten.
Zunächst war die Frage zu beantworten, ob es gelingt, mit der Cabodiimid-
Methode, bei der Retinolsäure und monoklonaler Antikörper über EDC
gekoppelt werden sollten, funktionsfähige Immunkonjugate herzustellen. Die
Kopplung war so zu optimieren, dass eine optimale Ausbeute an Antikörper
erreicht wird. Im ersten Schritt nach der Kopplung wurde in einem Zell-ELISA
getestet, ob die Bindungsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers auch nach der
Kopplung erhalten bleibt.
Mittels in vitro-Tests sollte gefunden werden, ob die Immunkonjugate im
Vergleich zu Kontrollsubstanzen (NaCl, Ethanol, Retinolsäure, Antikörper und
ungekoppeltes Gemisch aus Antikörper und Retinolsäure) das Zellwachstum der
Kulturzelllinie SK-N-MC hemmen.
Im Tierversuch wurde zunächst bei SCID-Mäusen ein Modell eines
disseminierten Neuroblastoms mit SK-N-MC-Zellen etabliert. An diesem Modell
sollte untersucht werden, ob durch die Behandlung mit Immunkonjugaten im
Vergleich zu Kontrollsubstanzen (NaCl, Retinolsäure, Antikörper und
ungekoppeltes Gemisch aus Retinolsäure und Antikörper) das Tumorwachstum
bei den Tieren vermindert und das Überleben verbessert werden könnte.
Immunzytologische (APAAP-Tests) und histochemische Tests sollten zeigen, ob
der Reifegrad der Tumorzellen nach der Behandlung mit den Immunkonjugaten
zunimmt.
Material und Methoden 23
5 Material und Methoden
5.1 Chemikalien
- BSA, Serva, Heidelberg
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PBS nach Gibco, 5fach konzentriert
Einfach konzentriert: auf 1 Liter Aqua dest. 0,21 g KH2PO4 + 0,726 g
Na2HPO4 x 7 x H20 + 9,00 g NaCl; pH 7,3
- DMSO, Serva, Heidelberg (Einfrierlösung: 50 % Medium, 45 % FKS, 5 %
DMSO)
- Ethylendiamintetraessigsäurelösung EDTA, Germed, Dresden
- Tris=Tris(hydroxymethyl)aminomethan, ICN Biomedicals Inc., Aurora, USA
- 6,1 g Tris + 8,8 g NaCl + 37,0 ml 1n HCl ad 1 l Aqua dest., pH 7,6+0,2
- 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC, Molekulargewicht
191,7; Pierce, Rockford, USA)
- All- trans-Retinolsäure (MW 300,4; ICN Biomedicals Inc., Aurora, USA)
- 2-(N-Morpholino)-ethan-sulfonsäure (MES, Pierce, Rockford, USA)
- Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva Blue G, Serva, Heidelberg)
- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-Diphenyl-Tetrazoliumbromid
(MTT, Sigma, Steinheim)
- Sodium-Dodecylsulfat (SDS, 2 %, ICN Biomedicals Inc., Aurora, USA)
- APAAP Kit System 40 Monoclonal (Dako, Hamburg)
- Glycergel (Dako, Hamburg)
5.2 Monoklonale Antikörper für Untersuchungen
- Anti-Neuroblastom-Antikörper 15/7 (Dr. A. Voigt, Jena), Antigen nicht
definiert
- MOPC-141-Antikörper (Sigma, Steinheim)
Material und Methoden 24
- Alkalische Phosphatase-konjugierter Kaninchen-anti-Maus-Antikörper
(Alkaline Phosphatase-Conjugated Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulin,
Dako, Hamburg)
- Schaf-Anti-Maus-Antikörper (Boehringer, Mannheim)
- Anti-Human Intercellular Adhesion Molecule-1-Antikörper (ICAM, CD 54,
Clone 6.5B5, Dako, Hamburg)
- Anti-Human Neural Cell Adhesion Molecule-Antikörper (NCAM, CD 56, Clone
UJ13A, Dako, Hamburg)
- Anti-Human Vascular Cell Adhesion Molecule-1-Antikörper (VCAM, CD 106,
Clone 1.4C3, Dako, Hamburg)
- Anti-Human Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-Antikörper (PECAM,
CD 31, Clone JC/70A, Dako, Hamburg)
- Anti-Insulin-like Growth Factor-1 Receptor-Antikörper (IGF-1-R, Dianova,
Hamburg)
- Anti-Transforming Growth Factor Receptor-Antikörper (TGF-R, CD 105,
Dako, Hamburg)
- Anti-Human Nerve Growth Factor Receptor-Antikörper (NGF-R, p 75, Dako,
Hamburg)
- Anti-beta-Tubulin (Clone KMX-1, Boehringer, Mannheim)
- Anti-Human Glial Fibrillary Acidic Protein-Antikörper für APAAP (GFAP,
Dianova, Hamburg)
- Anti-Human Neuroblastoma 84-Antikörper (NB 84, Dako, Hamburg)
- Anti-Human Neurofilament 68 kD-Antikörper (NF 68, Clone NR4, Medac
Diagnostika, Hamburg)
- 14G2a Anti-Disialogangliosid-Antikörper (GD2, von RA Reisfeld, La Jolla,
USA)
- Peroxidase-konjugierter Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (Dako,
Hamburg)
- Anti-Ki67 Antigen-Antikörper (Ki67, Clone MM1, Novocastra Laboratories
Ltd, Newcastle upon Tyne, UK)
- Anti-Human Neurofilament Protein-Antikörper (NF, Clone 2F11, Dako,
Hamburg)
Material und Methoden 25
- Anti-Human Chromogranin A-Antikörper (Chromogranin, clone DAK-A3,
Dako, Hamburg)
- Anti-Synaptophysin-Antikörper (Synaptophysin, Clone Snp88, BioGenex, San
Ramon, USA)
- Anti-Human Glial Fibrillary Acidic Protein-Antikörper für Immunhistochemie
(GFAP, Clone 6F2, Dako, Hamburg)
- Anti-S100-Antikörper (S100, Dako, Hamburg,)
- Anti-Alpha-Internexin-Antikörper (Clone 2E3, Novocastra Laboratories Ltd,
Newcastle upon Tyne, UK)
5.3 Zellkultur
- SK-N-MC, permanente Neuroblastomzelllinie
- Neuroblastom-Medium
Ansatz für zwei Liter:
HAM’S F12-Medium 10,71 g + IMDM-Medium 17,80 g
10 % fötales Kälberserum (FKS, Greiner, Frickenhausen)
50 mM Gentamicin (Ratiopharm, Ulm)
20 mM N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin, „stabiles Glutamin“ (Biochrom,
Berlin)
- CO2-Brutschrank (5 % CO2, 37 °C, Heraeus, Hanau)
- Sterile Werkbank Herasafe (Heraeus, Hanau)
5.4 Laborgeräte
- Plattenphotometer (Spektrometer und Computer: SLT Spektra, Crailsheim)
- Zytozentrifuge Cytospin 3 (Shandon, Pittsburgh, USA)
- Zentrifuge Universal 30 RF (Hettich, Tuttlingen)
Material und Methoden 26
5.5 Materialien
- Zellkulturplatten (mit sechs und 24 Vertiefungen) und -flaschen (Greiner,
Frickenhausen)
- Mikrotiterplatten (Flachbodenplatte, 96 Vertiefungen, Greiner,
Frickenhausen)
- Pipetten (Eppendorf, Hamburg)
- Filtrationskonzentrator „Centricon“ (Cutoff-Grenze 30 kDa, Millipore
Corporation, YM 30, Bedford, USA)
- Filtrationskonzentrator „Centriprep“ (Cutoff-Grenze 30 kDa, Millipore
Corporation, YM 30, Bedford, USA)
- Entsalzungssäule (D-Salt Excellulose Plastic Desalting Column, Pierce, 5 ml,
Rockford, USA)
- Spritzenfilter DynaGard; 0,2 µm (Mikrogon, Laguna Hills, USA)
- 1-ml-Feindosierungsspritze mit integrierter Kanüle der Größe 29 G
(Omnican, B. Braun Melsungen AG, Melsungen)
5.6 Monoklonale Antikörper für die Immunkonjugation
Der in dieser Arbeit für die Kopplung mit Retinolsäure verwendete monoklonale
Antikörper war der murine Antikörper 15/7. Er gehört der Immunglobulinsubklasse
IgG 2b an und hat ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa. Er wurde
ursprünglich durch die Hybridomtechnik gewonnen, indem Mäuse mit
Neuroblastomzellen immunisiert und anschließend ihre Milzzellen mit
Mausmyelomzellen fusioniert wurden (Voigt et al., 1993).
Nach der Gewinnung lag der Antikörper in PBS vor. Dieser Antikörper zeigt
außer zu Perineurium und interstitiellem Bindegewebe keine Kreuzreaktivität
gegenüber normalem und malignem Gewebe (Voigt et al., 1993).
Material und Methoden 27
5.7 Retinolsäure
Es wurde mit all- trans-Retinolsäure gearbeitet (Abb. 1). Die Retinolsäure lag in
Pulverform vor. Die Aufbewahrung erfolgte lichtgeschützt bei 4-8 °C. Aufgrund
der hohen Lichtempfindlichkeit wurde darauf geachtet, dass die Retinolsäure
bei allen Reaktionsschritten nur über minimale Zeiträume dem Licht ausgesetzt
war.
Abb.1: Formel für all- trans-Retinolsäure
Die in Wasser unlösliche Retinolsäure kann in Ethanol gelöst werden und bleibt
auch bei weiterem Verdünnen gelöst. Nach Herstellerangaben sind 3 mg
Retinolsäure in 10 ml 70%igem Ethanol löslich (Sigma Product Information
Sheet). In den vorliegenden Experimenten diente ein Verhältnis von 3 mg
Retinolsäure in 10 ml 96%igem Ethanol als Ausgangslösung (10-3 M). War die
Retinolsäure in dieser Ausgangsverdünnung noch unvollständig gelöst, wurde
bis zum vollständigen Lösen 1 n NaOH in 20 µl-Schritten zupipettiert. Der pH
wurde danach wieder durch Pipettieren von 1 n HCl auf den Wert von 4,7
eingestellt.
Für weitere Verdünnungen dieser Stammlösung diente mittels eines 0,2 µm-
Sterilfilters sterilisiertes Wasser. Für die Immunkonjugation wurde die
Stammlösung mit sterilem Konjugationspuffer 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure
(MES) weiter verdünnt.
O
OH
Material und Methoden 28
5.8 Konjugation von Retinolsäure und einem monoklonalen
Antikörper
5.8.1 Mediator
Als Mediator der Kopplung von all- trans-Retinolsäure an den monoklonalen
Antikörper, die vollständig unter keimarmen Bedingungen in einer Sicherheitswerkbank
stattfand, diente EDC (Abb. 2). Je nach Versuchbedingungen wurden
5 – 1000 µg EDC direkt vor Verwendung in Aqua destillata gelöst, diese Lösung
sterilfiltriert und unmittelbar zu der Antikörper-Retinolsäure-Lösung gegeben.
HCl-
CH3CH2 N C N (CH2)3 N+ CH3
CH3
Abb.2: Formel für EDC
5.8.2 Vorbereitung des Antikörpers
Von der in PBS vorliegenden Stammlösung des monoklonalen Antikörpers 15/7
wurden zunächst 50 µl für spätere Messungen wie Konzentrationsbestimmungen
und MTT-Test abgenommen. Danach erfolgte die Umpufferung
in den Konjugationspuffer MES. Dieser Konjugationspuffer bestand aus 0,1 M
MES; 0,9 M NaCl und 0,02 % NaN3. Der pH-Wert der Lösung, bei dem später
auch die Kopplungsreaktion ablief, wurde auf 4,7 eingestellt.
Als Filter für die Umpufferung diente der Ultrafiltrationskonzentrator „Centricon“
für ein Volumen von maximal 1 ml. Vor dem Versuch mußte die MES-Lösung
noch sterilfiltriert und der Centricon über eine Dauer von mindestens 30 min in
70%igem Ethanol desinfiziert werden.
Material und Methoden 29
Bis zum Versuchsbeginn wurde der Centricon-Filter steril abgedeckt, gekühlt
und gegen Austrocknung mit einer sterilen Lösung aus PBS mit 0,1 % BSA
gefüllt aufbewahrt. BSA blockierte in diesem Fall die Plastikoberfläche der
Filtrationsröhrchen, um Antikörperverluste durch unspezische Adhäsion an die
Oberfläche möglichst gering zu halten. Vor Versuchsbeginn wurden die
Centricon-Filter dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gespült, um in der
Lösung enthaltenes BSA zu entfernen. Von der Antikörperlösung wurde 1 ml in
einen Centricon eingefüllt und bei 3000 U/min für 20 min zentrifugiert. Das
Konzentrat wurde in Abhängigkeit von der Menge des Antikörpers mit MES
suspendiert und stand in dieser Lösung für die Kopplung zur Verfügung.
5.8.3 Vorbereitung der Retinolsäure
All- trans-Retinolsäure wurde wie in 5.7 beschrieben in Ethanol gelöst und
anschließend mit MES weiter verdünnt. Die erforderlichen Volumina der
Antikörper- und der Retinolsäurelösung wurden kurz vor der Kopplungsreaktion
miteinander vermischt (Abb. 3).
5.8.4 Kopplung
Die stets frisch hergestellte EDC-Lösung wurde zu dem Gemisch aus Antikörper
und Retinolsäure hinzugefügt. Dieser Reaktionsansatz inkubierte anschließend
zwei Stunden lichtgeschützt bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler.
Dabei bildeten sich das Antikörper-Retinolsäure-Konjugat und ein Harnstoffderivat
als Reaktionsprodukt des EDC. Nach dieser Inkubationszeit erfolgte die
Trennung der ungebundenen Retinolsäure und des Harnstoffderivats von der
Konjugatlösung mittels Gelfiltration (Herstellerempfehlung des Konjugationskits)
oder Zentrifugation.
Material und Methoden 30
Abb.3: Reaktionsgleichung für die EDC-Kopplung
Abtrennung der ungebundenen Retinolsäure durch Gelfiltration
Für die Gelfiltration wurde die Entsalzungssäule zunächst mit drei bis fünf
Säulenvolumina PBS äquilibriert. Die Konjugatlösung mit einem Gesamtvolumen
von etwa 1 ml wurde zuerst auf die Säule gegeben, danach in 0,5 ml-Schritten
PBS. Die Fraktionen, die je Auftrag auf die Säule gewonnen werden konnten,
wurden in einzelnen Röhrchen gesammelt. Nachdem das Totvolumen von etwa
zwei Milliliter aus der Säule entnommen war, konnten die konjugathaltigen
Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktionen, in denen Konjugat enthalten
war, wurden mit der Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt.
Auffällig war zum einen die deutliche gelbe Verfärbung der Säule nach der
Trennung. Darüberhinaus ergab der Proteinnachweis im Konjugat nach der
Trennung im Vergleich zum eingesetzten Antikörper nur eine Antikörperausbeute
von 15 % – 37 %. Beides sprach für hohe Verluste an Konjugat durch
Rückhalt oder nicht ausreichend mögliche Abtrennung aus der Säule.
O HCl-
R1C OH + CH3CH2N C N (CH2)3 N+ CH3
H+
CH3
HCl-
CH3CH2 NH C N (CH2)3 N+ CH3 + NH2R2
R1 C O CH3
O
O O H CH3
R1C N R2 + CH3CH2N C N (CH2)3N
H H CH3
Monoklonaler
Antikörper
Retinolsäure EDC
Instabiles Zwischenprodukt
Harnstoffderivat
Antikörper-
Retinolsäure-Konjugat
Material und Methoden 31
Abtrennung der ungebundenen Retinolsäure durch Zentrifugation
Als alternative Methode für die Trennung von ungebundener Retinolsäure und
dem Harnstoffderivat als Reaktionsprodukt des EDC auf der einen und dem
Antikörper-Retinolsäure-Gemisch auf der anderen Seite wurde daraufhin die
Zentrifugation mittels des Filtrationskonzentrators „Centriprep“ mit einem
Volumen von maximal 15 ml gewählt.
Der Centriprep wurde in gleicher Weise wie bereits der Centricon vorbehandelt.
Nach einer Desinfektion mit 70%igem Ethanol über mindestens 30 Minuten
blieb der Filter bis zum Versuchsbeginn steril abgedeckt, gekühlt und, um ein
Austrocknen zu vermeiden, aufgefüllt mit einer sterilen Lösung aus PBS mit
0,1 % BSA. Vor der Verwendung wurde der Filter dreimal mit steriler 0,9%iger
Kochsalzlösung gewaschen.
Die Konjugatlösung wurde dann in den „Centriprep“ eingefüllt und bis zur
15 ml-Markierung in 1 ml-Schritten mit sterilem 0,9%igem NaCl aufgefüllt. Die
Zentrifugation erfolgte bei 3000 U/min. Sie wurde in drei Schritten mit einer
Dauer von fünfzehn, zehn und fünf Minuten durchgeführt. Nach jedem Schritt
wurde die filtrierte Lösung gesammelt. Da die Cutoffgrenze des Filtrationskonzentrators
deutlich über der Molekülgröße der Retinolsäure lag, wurde im
Gegensatz zum Konjugat die freie, ungekoppelte Retinolsäure nicht vom Filter
zurückgehalten. Dieser Anteil konnte anschließend im Filtrat bestimmt werden.
5.8.5 Vorbereitung des Konjugates für die Versuche
Das Konzentrat wurde steril in ein Röhrchen aufgenommen und mit steriler
0,9%iger NaCl-Lösung auf das Volumen gebracht, das für Tierversuche und in
vitro-Bestimmungen notwendig war.
Von dieser Lösung wurden die notwendigen Volumina für die Messung der
Antikörperkonzentration, für den Zell-ELISA zum Test der Bindungsfähigkeit des
Konjugates und für den Proliferations-(MTT-)Test entnommen.
Material und Methoden 32
Der verbleibenden Restlösung wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von
10 µg/ml zugesetzt, die Einwirkzeit betrug mindestens acht Stunden.
Die Konjugatlösung wurde anschließend in sterile Röhrchen so portioniert, dass
sie unmittelbar für die einzelnen Tierversuchstage verwendet werden konnte.
5.9 In vitro-Testung der Konjugate
5.9.1 Konzentrationsbestimmung
Proteinbestimmung nach Bradford zur Konzentrationsbestimmung
des Antikörpers
Zur Messung der Konzentration des Antikörpers im Antikörper-Retinolsäure-
Konjugat dienten verschiedene Methoden. Unspezifische und spezifische
Nachweismethoden wurden parallel durchgeführt.
Als unspezifische Methoden zum Proteinnachweis standen die Verfahren nach
Bradford und nach Lowry zur Verfügung. Voraussetzung für beide Methoden
war jeweils das Vorhandensein einer Proteinlösung, die nur eine Art von Eiweiß
enthielt, in unserem Fall den Antikörper.
Für jeden Versuch wurden drei Parallelen vermessen und aus den Ergebnissen
der Mittelwert bestimmt.
Die Bradfordmethode beruht auf der Verwendung des Farbstoffes Coomassie
Brilliant Blue G-250. Wenn der Farbstoff an Protein bindet, wechselt die Farbe
von rot zu blau. Der Protein-Farbstoff-Komplex hat einen hohen Extinktionskoeffizienten,
dadurch ist die Messung sehr sensitiv. Dieser Farbstoffassay ist
etwa viermal so sensitiv wie der Lowryassay (Bradford, 1976).
Für den Vorratspuffer wurden 350 mg Serva Blue G in 100 ml 95 % Ethanol
gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 ml 88 % H3PO4 hinzugefügt und diese
Lösung abgedunkelt bei Raumtemperatur aufbewahrt. Für Nachweisreaktionen
wurde ein Arbeitspuffer hergestellt aus 1,2 ml der Ausgangslösung mit 0,6 ml
95 % Ethanol; 1,2 ml 88 % H3PO4 und dieser mit 17 ml Aqua bidestillata auf
ein Endvolumen der Farbstofflösung von 20 ml aufgefüllt.
Material und Methoden 33
Jeweils 20 µl der zu messenden Proteinlösung wurden in 96er-Mikrotiter-Platten
mit Flachboden mit 200 µl der Farbstofflösung versetzt und die Extinktion bei
620 nm am Plattenphotometer bestimmt. Aus der Extinktion wurde mit Bezug
auf eine Standardkurve mit BSA von 5 – 200 µg/ml die Proteinkonzentration
berechnet.
Proteinbestimmung nach Lowry zur Konzentrationsbestimmung des
Antikörpers
Der Proteinnachweis nach Lowry wird mit einem alkalischen Kupferreagenz
durchgeführt, in der sich auch präzipitierte Proteine rasch auflösen und somit
gut nachweisbar sind. Die Farbreaktion beruht auf der Bindung des Farbstoffs
an Tryptophan und Tyrosin im Protein und läuft in zwei Schritten ab. Zunächst
reagiert das Protein in dieser alkalischen Lösung mit dem Kupfer, anschließend
wird das Folinreagenz durch das kupferbehandelte Protein reduziert (Lowry et
al., 1951).
Diese Meßmethode mit Kupfer und Folinreagenz ist sensitiv und einfach. Ihre
Nachteile sind jedoch die je nach Protein variierende Intensität der Färbung und
die nicht strenge Proportionalität des Färbeausmaßes zur Konzentration (Lowry
et al., 1951).
Die Bestimmung der Antikörperkonzentration erfolgte mit Bezug auf eine
Standardkurve mit bekannten BSA-Konzentrationen von 50 bis 1000 µg/ml. Die
unbekannte Probe wurde zu 50 µl in eine Mikrotiterplatte mit Flachboden
pipettiert. Anschließend erfolgte für fünf Minuten die lichtgeschützte Inkubation
mit 50 µl der Umsatzlösung, die sich aus 1 ml 1 % CuSO4, 1 ml 2 % K-Na-
Tartrat und 50 ml Na2CO3 in 1 n NaOH zusammensetzte. Für 30 Minuten
erfolgte dann die Inkubation mit 50 µl 2 n Folinreagenz. Im Anschluß wurde bei
Raumtemperatur die Extinktion der Lösung bei 690 nm gemessen.
Material und Methoden 34
Proteinbestimmung mittels Enzyme linked immunosorbent assay
Die Methoden des Proteinnachweises nach Bradford und nach Lowry sind beide
einfach und rasch durchführbare Tests. Mit beiden Verfahren war jedoch eine
zu hoch gemessene Proteinkonzentrationen im Konjugat zu erwarten, da die
Filter Centricon und Centriprep vor ihrer Benutzung mit BSA blockiert wurden
und auch nach dem Spülen mit geringen Restmengen an BSA zu rechnen war.
Parallel erfolgte aus diesem Grund zum Vergleich die Proteinmessung mit der
aufwendigeren aber spezifischeren immunchemischen Nachweismethode
Peroxidase-ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay).
Die Grundlage dieser Technik ist die Erkennung von murinen Antikörpern
mittels Antigen-Antikörper-Reaktion. Der Nachweis fand in 96-well-Mikrotiterplatten
mit Flachboden statt, die mit einem Wandantikörper (Schaf-IgG gegen
Mausimmunglobulin) beschichtet waren und bei –24 °C aufbewahrt wurden. An
diesen Wandantikörper binden die monoklonalen Mausantikörper über ihren Fc-
Teil sowohl in nativer Form als auch in Form der Antikörper-Retinolsäure-
Konjugate.
Als Bezug für die Antikörperkonzentration diente eine Standardkurve mit
Konzentrationen von 0,01 µg/ml bis 0,2 µg/ml von MOPC-141-Antikörper, der
wie der 15/7-Antikörper der Immunglobulinsubklasse IgG2b angehört. Jeweils
50 µl der bekannten Standard-Konzentration und von Verdünnungen
(hergestellt mit 0,1 % BSA/PBS) der unbekannten Antikörper- und Konjugatkonzentrationen
wurden in die Mikrotiterplatte pipettiert. Nach 30 Minuten
Inkubation bei Zimmertemperatur auf dem Plattenschüttler wurde der
Überstand abgekippt und je well dreimal mit 200 µl 0,1 % BSA/PBS gewaschen.
Anschließend wurde Peroxidase-konjugiertes Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin
hinzugegeben, das an den murinen monoklonalen Antikörper binden würde. Die
Inkubation mit je 100 µl einer Verdünnung aus 3 µl Peroxidasekonjugat und
5 ml Verdünnungspuffer (0,1 % BSA/PBS) dauerte 30 min. Danach wurde die
Platte erneut dreimal mit 200 µl 0,1 % BSA/PBS je well gewaschen. Als Substrat
für die Peroxidase diente anschließend Orthophenyldiamin.
Material und Methoden 35
Eine Tablette mit 10 mg Orthophenyldiamin wurde in 50 ml Citratpuffer
(5 g Zitronensäuremonohydrat + 7 g Na2HPO4, aufgefüllt mit 500 ml Aqua
destillata, pH 5,0) gelöst und zu dieser Lösung 6 µl Wasserstoffperoxid
hinzugefügt. Je well erfolgte eine Inkubation mit 100 µl Substratlösung, die
Inkubationsdauer betrug in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit des
Farbumschlags 10 bis 50 Minuten. Danach wurde die Reaktion mit einer
Stopplösung (50 µl 6 n H2SO4 je Napf) abgebrochen und die Extinktion der
rotbraunen Lösung bei 492 nm vermessen. Auf der Basis des
Computerprogramms wurde die Proteinkonzentration im Vergleich zur
Standardkurve berechnet.
Wichtig für die Auswertbarkeit der Messung war die korrekte Verdünnung der
vorliegenden unbekannten Antikörperlösung, deren Konzentration für die
Messung zwischen 0,01 und 0,2 µg/ml liegen sollte.
Retinolsäure-Konzentrationsbestimmung
Für die Ermittlung der Retinolsäure-Konzentration im Konjugat wurde eine
eigene Methode etabliert, die sich ebenso auf die Messung der Extinktion
stützte. Das Absorptionsmaximum für all- trans-Retinolsäure liegt bei 340 nm,
also im ultravioletten Bereich. Aufgrund der uns zur Verfügung stehenden
technischen Möglichkeiten bestimmten wir die Absorption der Retinolsäure bei
405 nm bei einem pH von 7,0. Durch diese Messung würde hauptsächlich die
Retinolsäure erfaßt werden, da das Absorptionsmaximum von Proteinen, die
Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan enthalten, bei 280 nm liegt (Wetlaufer,
1962).
Zunächst wurde eine Standardkurve mit jeweils 200 µl von bekannten
Retinolsäurekonzentrationen, verdünnt mit NaCl, pH etwa 7,0, aufgestellt. Diese
Kurve wurde für alle weiteren Kopplungsversuche verwendet. So konnte aus
einer gemessenen Extinktion die Konzentration der Retinolsäure zurückgerechnet
werden. Diese Eichkurve verlief nicht in allen Abschnitten linear.
Material und Methoden 36
Verdünnungen der zu vermessenden Lösungen wurden so gewählt, dass die
abgeschätzte Retinolsäurekonzentration in der Verdünnung im linearen Anteil zu
erwarten war. Nach einer Immunkonjugation wurden 200 µl des Konjugates
entnommen und die enthaltene Retinolsäure bestimmt.
5.9.2 Bindungsfähigkeit der Konjugate
Vorbereitung des Tests
Um zu prüfen, ob es durch die Kopplung nicht zu einer Beeinträchtigung der
Bindungsfähigkeit des Antikörpers käme, wurde ein Zell-ELISA durchgeführt. In
diesem Test sollte das Ausmaß der Bindung gleicher Konzentrationen des
nativen Antikörpers und des Antikörpers im Antikörper-Retinolsäure-Konjugat
an Neuroblastomzellen untersucht werden.
Zunächst wurden SK-N-MC-Tumorzellen geerntet und mit 0,1 % BSA/PBS/EDTA
auf 1-2 x 106/ml eingestellt. Zeitgleich wurde eine 96-well-Mikrotiterplatte
(Flachboden) 30 Minuten mit 1 % BSA/PBS blockiert, um eine unspezifische
Bindung des Antikörpers an die Plastikoberfläche gering zu halten, und
anschließend ausgeklopft. Die vorbereiteten Zellen wurden zu je 100 µl in die
Platte ausgesät. Es erfolgte eine Zentrifugation für fünf Minuten bei 1000 U/min
und ein Ausklopfen der Platte.
Durchführung des Tests
Die das Antigen tragenden Zellen wurden mit Verdünnungen (hergestellt mit
0,1 % BSA/PBS) des nativen anti-Neuroblastom-Antikörpers und des
Konjugates sowie mit einer Negativkontrolle (0,1 % BSA/PBS) eine Stunde lang
abgedunkelt bei Zimmertemperatur auf dem Plattenschüttler inkubiert. Ziel war
es, jeweils gleiche Konzentrationen von nativem und gekoppeltem Antikörper
vergleichen zu können. Die Platte wurde nach diesem ersten Schritt dreimal
jeweils mit 200 µl 0,1 % BSA/PBS je Napf gewaschen und fünf Minuten mit
1000 U/min zentrifugiert.
Material und Methoden 37
Anschließend erfolgte für eine Stunde die Inkubation mit einem alkalische
Phosphatase-konjugierten Kaninchen-anti-Maus-Antikörper. Dazu wurde eine
Verdünnung von 5 µl Phosphatasekonjugat mit 5 ml Verdünnungspuffer (0,5 %
BSA/PBS) und 2,5 mg Tween hergestellt. Von dieser Konjugatlösung wurden je
Napf 100 µl pipettiert. Danach wurde die Platte erneut dreimal jeweils mit
200 µl 0,1 % BSA/PBS je well gewaschen und fünf Minuten bei 1000 U/min
zentrifugiert.
Unmittelbar vor der Verwendung wurde die Substratlösung hergestellt. Dazu
wurden 9,33 mg 4-Nitrophenyl-Phosphat in 10 ml Puffer (1 mol/l
Diethanolamin, 0,5 mmol/l MgCl2) gelöst. Je well erfolgte eine Inkubation mit
100 µl Substratlösung abgedunkelt bis zu einem Farbumschlag von farblos zu
gelb. Die Extinktion der Lösung wurde bei 405 nm nach fünf und nach zehn
Minuten am Plattenphotometer gemessen.
5.9.3 Beeinflussung des Zellwachstums
MTT-Test direkt nach der Kopplung
Der Einfluß des Konjugates auf Lebensfähigkeit und Wachstum von
Neuroblastomzellen in der Kultur im Vergleich zum nativen Antikörper, Retinolsäure
und dem ungekoppelten Gemisch aus Antikörper und Retinolsäure wurde
mit dem MTT-Test untersucht. In Abhängigkeit von der Aktivität mitochondrialer
Dehydrogenasen lebender Zellen wird der Tetrazoliumring des MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)diphenyl-tetrazoliumbromid) aufgebrochen, und es
entsteht dunkelblaues wasserunlösliches Formazan. Das Formazan wird dann
durch das Detergenz Sodium-Dodecylsulfat (SDS) aufgelöst und bei 570 nm
photometrisch bestimmt.
Für den Versuch wurden SK-N-MC-Zellen in einer Konzentration von 2 x 104/ml
zu je 100 µl in eine Mikrotiterplatte ausgesät und über Nacht im Brutschrank
kultiviert. Je Versuchsgefäß wurden 10 µl der Testsubstanzen in vergleichbaren
Konzentrationen (Konjugat, Antikörper, Retinolsäure, ungekoppeltes Gemisch,
Negativkontrollen Ethanol als Lösungsmittel für Retinolsäure und Medium als
Material und Methoden 38
Lösungsmittel für Antikörper und Konjugat) insgesamt dreimal im Abstand von
zwei Tagen zur Kultur gegeben. Im Anschluß wurden 10 µl MTT pro well
pipettiert und vier Stunden bei 37 °C inkubiert. Danach wurden 100 µl SDSLösung
pro Napf pipettiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach zehn
Minuten Schütteln erfolgte dann die photometrische Messung bei 570 nm
(gegen eine Referenzwellenlänge von 690 nm) am Plattenphotometer.
MTT-Test nach drei, neun und 28 Tagen nach der Kopplung
Jeder Tierversuch war über eine Dauer von etwa drei bis vier Wochen geplant.
Für jeden Versuch sollte in einer einzigen Kopplung ausreichend Konjugat für
alle Applikationen hergestellt werden. Die Peptidbindung im Immunkonjugat
sollte also im günstigsten Fall über die Dauer von drei bis vier Wochen stabil
bleiben. Daher erfolgte nach drei, neun und 28 Tagen mit dem Konjugat ein
erneuter MTT-Test, um die Stabilität des Konjugates überprüfen zu können. Die
Extinktion der Kultur nach Konjugatinkubation wurde mit der nach Inkubation
mit dem ungekoppelten Gemisch aus Antikörper und Retinolsäure verglichen.
Die Kulturen wurden während der Inkubationszeit mit den Testsubstanzen auch
morphologisch auf die Ausbildung von Neuritenfortsätzen als Zeichen einer
möglichen Reifung untersucht.
5.10 Versuchstiere
Die Tierversuche wurden an weiblichen Mäusen mit schwerem kombinierten
Immundefekt (severe combined immunodeficiency, SCID) durchgeführt. Die
Tiere stammten aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen
Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Standort Tierhaus III,
Beutenberg, wo sie während der Versuche unter Barrierehaltung gehalten
wurden.
Für die Versuche dienten sechs bis acht Wochen alte weibliche Mäuse. Die Tiere
lebten in Gruppen von vier bis fünf in einem Uniprotect Luftstromschrank
(Käfige und Luftstromschrank von der Firma EHRET).
Material und Methoden 39
Sie wurden ad libitum mit 1434 Nacktratte/Nacktmaus Z/H Pelletfutter der
Firma Altromin gefüttert. Als Tränkwasser wurde autoklaviertes auf einen pH
von 2,7 – 3,2 angesäuertes Leitungswasser ad libitum verabreicht. Die
Versuchstiere wurden einmal pro Woche unter der Flowbox umgesetzt und
zweimal wöchentlich gewogen. Das Raumklima war durch eine Haltungstemperatur
von 23 °C und eine Luftfeuchte von 40 – 60 % charakterisiert.
Eine Genehmigung des Versuchsvorhabens nach §8 Abs.1 des Tierschutzgesetzes
durch das Thüringer Ministerium für Gesundheit und Soziales lag vor.
5.11 Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Modells
5.11.1 Tumorzellen
SK-N-MC-Zellen zur Etablierung des Tiermodells waren entweder bei –196 °C in
flüssigem Stickstoff kryokonserviert oder stammten direkt aus der Kultur in
Neuroblastommedium. Neuroblastomzellen aus flüssigem Stickstoff wurden im
Wasserbad auf eine Temperatur von 37 °C gebracht, das Medium nach einer
kurzen Zentrifugation abgezogen und die Zellen in physiologischer Kochsalzlösung
aufgenommen. Aus der Kultur wurden die Zellen in der logarithmischen
Wachstumsphase nach einer zehnminütigen Inkubation mit 20 mM EDTA und
einem Waschvorgang mit PBS als Einzelzellsuspension in physiologischer
Kochsalzlösung aufgenommen.
Nach der Färbung mit Trypanblau wurden die Tumorzellen in einer Neubauerkammer
gezählt und mit physiologischer Kochsalzlösung auf die gewünschte
Zellkonzentration eingestellt.
5.11.2 Modelletablierung
SCID-Mäuse im Alter von vier bis sechs Wochen erhielten über eine 1-ml-
Feindosierungsspritze mit integrierter Kanüle der Größe 29 G eine Injektion von
300 µl der Zellsuspension mit der eingestellten Zellkonzentration.
Material und Methoden 40
Je Versuchstier wurde dieses Volumen entweder vollständig intraperitoneal oder
intravenös oder unmittelbar nacheinander 50 % intravenös in eine Schwanzvene
und 50 % intraperitoneal injiziert. Für die intraperitoneale Injektion wurde
nach Sprühdesinfektion perkutan ein unterer Quadrant des Abdomens
punktiert. Vor der intravenösen Injektion erfolgte zunächst eine Immersion des
Schwanzes in angewärmtes Wasser für etwa zwei Minuten, um eine
Vasodilatation zu erreichen. Die Mäuse wurden vorsichtig manuell fixiert und
nach Sprühdesinfektion eine Schwanzvene punktiert.
Gruppen von zwei bis vier Mäusen erhielten eine Injektion mit einer definierten
Zellzahl, zunächst nur intraperitoneal oder intravenös. Hinsichtlich des
Auftretens klinischer Zeichen für eine Krankheitsmanifestation wie gekräuseltes
Fell, Lähmung, palpabler Tumor oder Gewichtsverlust erfolgte die tägliche
Beobachtung der Tiere und zweimal wöchentlich eine Gewichtskontrolle.
Versuchsende
Bei beginnenden Erkrankungszeichen folgte umgehend die Tötung der Tiere
durch Ether und die makroskopische Untersuchung der Organe auf Tumorbefall.
Während der Präparation der SCID-Mäuse wurden von den Organen Proben
entnommen. Aus diesen Proben wurden in Zellkulturplatten Zellsuspensionen
angelegt und diese im Brutschrank kultiviert. Durch regelmäßige
lichtmikroskopische Beurteilung der Zellkultur konnte der Verdacht auf ein
eventuelles Aufwachsen der SK-N-MC-Zellen gestellt werden, und zwar dann,
wenn die für SK-N-MC-Zellen typische spindelförmige Zellform mit
neuritenartigen Ausläufern erkennbar war.
Ein Organ galt als von Neuroblastomzellen befallen, wenn entweder
makroskopisch der Tumor sichtbar war oder in der Zellkultur aus der
Organprobe SK-N-MC-Zellen aufwuchsen, auch ohne dass eine makroskopische
Absiedlung vorlag. Zeigte eine Maus nach bis zu zwölf Wochen keine
Krankheitszeichen, wurde sie getötet und auf Tumorbefall untersucht.
Material und Methoden 41
5.12 In vivo-Experimente
5.12.1 Letale Dosis der all- trans-Retinolsäure
Vor Beginn der Tierversuche mußte ausgeschlossen werden, dass durch die
Retinolsäure selbst letale Effekte auftreten, die das Versuchsergebnis
verfälschen. Dazu wurde die Dosis der Retinolsäure bestimmt, bei der zehn
Prozent der Tiere nach einer Einzelinjektion verstarben (LD10).
Klinische Studien bei an Krebs erkrankten Kindern (Smith et al., 1992) zeigten
eine maximale tolerierte Dosis der all- trans-Retinolsäure von 60 mg/m2
Körperoberfläche/d. Für die Bestimmung der auf die Körperoberfläche
bezogenen LD10 wurde als Testdosis eine im Vergleich zur
Neuroblastomtherapie bei Kindern zehnfache Dosis getestet.
Rechnerische Grundlage war die Formel zur Berechnung der Körperoberfläche
Körperlänge in cm X Körpermasse in kg
KOF =
3600
.
Für eine Maus mit der durchschnittlichen Länge von 10 cm und einer Masse von
25 g errechnet sich eine Körperoberfläche von 83,3 cm2. Nach Verzehn-fachung
der Dosis aus dem Therapieprotokoll des Neuroblastoms ergibt sich eine
Tagesdosis für die Bestimmung der LD10 von 5 mg je Versuchstier.
Die Versuchstiere erhielten eine intraperitoneale Injektion der Retinolsäure,
gelöst in 10 % Ethanol. Kontrolltiere erhielten eine 10%ige Ethanollösung als
intraperitoneale Injektion.
Material und Methoden 42
5.12.2 Beeinflussung des Tumorwachstums durch Immunkonjugate
Die Anzahl und die Masse der Tumoren je Versuchstier sollte unter dem Einfluß
des Antikörper-Retinolsäure-Konjugates untersucht werden und mit Tumorzahl
und Tumormasse unter dem Einfluß des Antikörpers und der Retinolsäure
jeweils allein, des ungekoppelten Antikörper-Retinolsäure-Gemischs und
physiologischer Kochsalzlösung als Negativkontrolle verglichen werden.
Für jeden Tierversuch wurde eine separate Kopplung von Antikörper und
Retinolsäure durchgeführt. Am Tag 0 wurde den Versuchstieren 300 µl einer
SK-N-MC-Zellsuspension mit 2 x 107 Zellen in sterilem 0,9 % NaCl zu je 50 %
intravenös und 50 % intraperitoneal injiziert. Am zweiten bis dritten Tag
wurden je Maus 300 µl der entsprechenden Testsubstanz intraperitoneal
injiziert. Insgesamt wurden die Testsubstanzen je Maus im Abstand von zwei
bis drei Tagen ein- bis sechsmal appliziert. Die Mäuse wurden während der
Versuchsphase täglich auf Krankheitszeichen untersucht und zweimal
wöchentlich gewogen. Nach einer definierten Zeit (20 bis 22 Tage) wurden die
Mäuse durch Ether getötet.
5.12.3 Postmortale Untersuchung der Versuchstiere
Alle Tiere aus der Versuchsreihe Tumorwachstum wurden seziert und auf
makroskopischen Tumorbefall untersucht. Die Zahl der Tumoren und deren
genaue Größe wurden notiert. Anhand der Maße wurde die Tumormasse (W) in
Gramm nach der Formel W=(a2xb)/2 berechnet, wobei a die Breite und b die
Länge des Tumors in Zentimeter waren (Ovejera et al., 1978). Nach Ovejero
gilt diese Formel vereinfacht für ein Ellipsoid und kann als gültige Annäherung
angesehen werden, wenn eine einheitliche Dichte des Tumors angenommen
wird.
Von Tumor, Leber, Milz, Niere, Gehirn, Herz, Lunge und Knochenmark wurden
Proben entnommen. Diese Proben wurden in Kulturplatten mit je sechs
Vertiefungen in Neuroblastommedium mit 10 % fetalem Kälberserum und
50 mM Gentamicin aufgenommen.
Material und Methoden 43
Diese Platten wurden im Brutschrank aufbewahrt und mikroskopisch regelmäßig
auf das Anwachsen von für das Neuroblastom typisch erscheinenden Zellen mit
neuritenartigen Ausläufern untersucht. Gleichzeitig wurden für spätere
immunchemische Untersuchungen stark zerkleinerte Proben von den Tumoren
und Organen in einer Lösung aus 50 % Neuroblastommedium, 45 % fetalem
Kälberserum und 5 % DMSO in flüssigem Stickstoff eingefroren. Aus diesen
eingefrorenen Organproben wurden später Zytozentrifugenpräparate hergestellt
und immunzytologisch angefärbt.
Außerdem wurden von ausgewählten Organen Paraffinschnitte angefertigt und
mit immunhistochemischen Methoden angefärbt (Institut für Pathologie). Dazu
wurden die Schnitte mit Antikörpern gegen die Oberflächenantigene Ki67, S100,
Chromogranin, Synaptophysin, GFAP, Alpha-Internexin und Neurofilament
gefärbt. Die Auswertung der Färbung erfolgte nach dem gleichen Schema wie
im Falle der APAAP-Färbung (siehe 5.12.5).
5.12.4 Beeinflussung der Überlebenszeit durch Immunkonjugate
Wie im Versuch zum Tumorwachstum wurde den Versuchstieren am Tag 0
300 µl einer Zellsuspension mit 2 x 107 Neuroblastomzellen zu 50 % intravenös
und 50 % intraperitoneal injiziert. Ab Tag zwei wurden insgesamt sechsmal im
Abstand von zwei bis drei Tagen 300 µl jeder Testsubstanz intraperitoneal
appliziert. Wie im vorherigen Versuch wurden die Tiere täglich beobachtet und
zweimal wöchentlich gewogen. Verstarb eine Maus, wurde die Überlebensdauer
notiert. Sobald bei einer Maus eindeutige Krankheitszeichen auftraten, wurde
sie getötet und die Überlebensdauer notiert.
Die Tiere aus diesem Versuch wurden postmortal nicht mehr untersucht.
Material und Methoden 44
5.12.5 Immunzytologische Färbung
Einleitung
Zytozentrifugenpräparate von Tumor- und Organproben sollten auf ihre
immunologischen Oberflächeneigenschaften untersucht werden, um ihre
Zuordnung zu Neuroblastomzellen und deren Merkmale überprüfen zu können.
Die Antigenexpression auf den Tumorzellen wurde mit der APAAP-Methode
untersucht. Die Grundlage dieses Verfahrens sind alkalische Phosphatase-anti
alkalische Phosphatase-Immunkomplexe (Cordell et al., 1984). Das Substrat für
die alkalische Phosphatase ist Fast Red, aus dem ein rotes Reaktionsprodukt
entsteht. Gegen die Hintergrundfärbung mit Hämatoxilin ergibt sich auch bei
wenigen positiven Zellen ein gut erkennbarer Kontrast.
Vorbereitung der Proben
Für die Herstellung der Zytozentrifugenpräparate wurden die Röhrchen mit den
gefrorenen Organproben im Wasserbad rasch bei 37 °C bis zur Eisschmelze
aufgetaut. Der Röhrcheninhalt (etwa 1 ml) wurde mit 4 ml kühlschrankkaltem
Neuroblastommedium mit 10 % fetalem Kälberserum bei 1000 U/min 5 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt und der Bodensatz mit dem
Medium auf das Volumen gebracht, das für die Konzentrationsbestimmung und
die Tierversuche benötigt wurde. Mittels Zytozentrifuge wurden jeweils 100 µl
dieser Zellsuspension auf einen Objektträger aufgetragen und sofort zwei
Minuten in eiskaltem Aceton fixiert.
Durchführung des Tests
Die acetonfixierten Zellen wurden zunächst 30 min mit je 50 µl 1 % BSA/Tris
blockiert. Da mit der APAAP-Methode gearbeitet wurde, mußte eine
phosphatfreie Lösung benutzt werden. Nach dem Dekantieren der Blockierlösung
wurden je 30 µl des entsprechenden primären Antikörpers aufpipettiert
und bei Zimmertemperatur in einer feuchten Kammer für 30 min inkubiert.
Material und Methoden 45
Als primäre Antikörper dienten: 15/7, ICAM, NCAM, VCAM, PECAM, IGF-1-R,
TGF-R, NGF-R, Anti-beta-Tubulin, GFAP, NB 84, NF 68, GD2. Als Negativkontrolle
wurde anstelle des Primärantikörpers 0,1 % BSA/Tris verwendet.
Der Test wurde mit einem APAAP Kit nach Herstellerangaben durchgeführt. Die
Inkubation mit der APAAP-Lösung wurde bis zu dreimal für je zehn Minuten
wiederholt, um eine intensivere Färbung zu erreichen. Je nach Ausmaß der
Farbreaktion inkubierte die Fast Red Substratlösung über eine Dauer von 20 bis
60 Minuten.
Auswertung des Tests
Nach der Einbettung des Präparates mit Glycergel erfolgte die mikroskopische
Auswertung der Färbung.
Die Anzahl der gefärbten Zellen wurde folgendermaßen bewertet:
- 0 – 5 % „-“
- 6 – 25 % „+“
- 26 – 50 % „++“
- 51 – 75 % +++“
- 76 – 100 % „++++“.
5.13 Statistische Auswertung
Die Bearbeitung der Daten erfolgte mit den Programmen Microsoft Word und
Microsoft Excel. Die statistische Auswertung wurde mit SPSS 10.0 für Windows
durchgeführt.
Signifikanzniveaus für die Resultate aus den Versuchen zu MTT-Test,
Tumorwachstum und Überlebenszeit wurden mit dem Mann-Whitney-Test
berechnet. Ein p-Wert kleiner 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse 46
6 Ergebnisse
6.1 Konjugation von Retinolsäure und einem monoklonalen
Antikörper
All- trans-Retinolsäure wurde mit der Carbodiimid-Methode an den
monoklonalen Antikörper 15/7 gekoppelt. Unter der Einwirkung von EDC als
Vermittler der Reaktion entstand am Protein eine aktivierte Carboxylgruppe, an
der Retinolsäure über eine Peptidbindung angekoppelt werden konnte. In den
ersten Versuchen traten große Verluste des eingesetzten Antikörpers auf
(Abb. 4).
0 20 40 60 80 100 120 140 160
1
2
3
4a
4b
5a
5b
6a
6b
7
8
9
10
11
12
13a
13b
14a
14b
15a
15b
16a
16b
17a
17b
gekoppelter Antikörper 15/7 (%)
Eingesetzter Antikörper
Eingesetzte Retinolsäure
Eingesetztes EDC
Abb.4: Optimierung der EDC-Kopplung (Ausbeute an Antikörper)
Die Balken zeigen die Ausbeute an gekoppeltem Antikörper 15/7 im Verhältnis zum nativen
Antikörper. Jeder Balken setzt sich aus dem Verhältnis von eingesetztem Antikörper, EDC und
Retinolsäure zusammen. Dem Diagramm können außerdem die Nummer des Versuches sowie
die Methode des Proteinnachweises entnommen werden.
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Lowry
ELISA
ELISA
ELISA
ELISA
ELISA
ELISA
Lowry
Nicht durchgeführt
Siehe Erklärungen im Abschnitt Diskussion
ELISA
Die Trennung von gekoppelter und ungekoppelter
Retinolsäure erfolgte in den Versuchen 1 bis 4a durch
Gelfiltration und ab Versuch 4b durch Zentrifugation
(Centriprep).
Ergebnisse 47
Anfangs lag die Ausbeute bei nur 34 %. Die Menge des eingesetzten EDC
wurde reduziert, da bekannt ist, dass bei zu hohen Konzentrationen an EDC das
Proteinkonjugat ausfallen kann. Nach deutlicher Reduktion des EDC auf 50 %
und in einem weiteren Schritt bis auf 0,5 % der Ausgangsmenge, konnte
jedoch eine Ausbeute von ebenfalls nur 32 % beziehungsweise 15 % erzielt
werden.
Nach der Trennung der ungekoppelten Retinolsäure vom Antikörper war in der
Säule ein Anteil des Konjugates in Form einer gelben Bande sichtbar.
Nachspülen der Säule mit Ethanol führte lediglich zu einer geringen
Auswaschung, so dass die Ausbeute daraufhin 37 % betrug.
Deshalb erfolgte der Wechsel der Methode zur Trennung mit einem
Zentrifugationskonzentrator. Der Cutoff des Filters lag bei etwa 30 kDa,
demzufolge genau zwischen dem Molekulargewicht der Retinolsäure mit
0,3 kDa und dem Molekulargewicht des monoklonalen Antikörpers mit etwa
150 kDa. Dadurch konnte auf diese Weise ungebundene Retinolsäure vom
Antikörper getrennt werden. Eine Trennung des möglicherweise noch
ungekoppeltem vom gekoppelten Antikörper konnte mit dieser Methode nicht
erfolgen. Da die Kopplung von Retinolsäure an den Antikörper Voraussetzung
für die vorliegenden Untersuchungen war, sollte die Retinolsäure vor der
Kopplung im Überfluß vorliegen, so dass kein ungekoppelter Antikörper
verbleiben würde.
Nach Umstellung der Trennungsmethode konnte eine Antikörperausbeute von
45 % erzielt werden.
Gleichzeitig wurde im Verhältnis zum monoklonalen Antikörper weniger
Retinolsäure eingesetzt.
Um für den Tierversuch eine sterile Konjugatlösung verfügbar zu haben,
erfolgte nach der Kopplung eine Sterilfiltration. Dabei traten ausgeprägte
Antikörperverluste auf (Abb. 5).
Ergebnisse 48
0 10 20 30 40 50 60 70
1 (Bradford)
2 (Bradford)
3 (Bradford)
4a (Bradford)
4b (Bradford)
5a (Bradford)
5b (Lowry)
6a (Bradford)
6b (Lowry)
Versuchsnummer
Ausbeute (%)
gekoppelter Antikörper vor der Sterilfiltration
gekoppelter Antikörper nach der Sterilfiltration
Abb.5: Verluste an Antikörper-Retinolsäure-Konjugat durch die Sterilfiltration
Die Trennung von gekoppelter und ungekoppelter Retinolsäure erfolgte in den Versuchen 1 bis
4a durch Gelfiltration und ab Versuch 4b durch Zentrifugation (Centriprep). Dargestellt ist zu
jedem Versuch die Nachweismethode des Antikörpers im Konjugat (Bradford oder Lowry).
Auf diese die Ausbeute vermindernde Filtration konnte verzichtet werden, nachdem
für die Kopplung keimfreie Materialien eingesetzt worden waren. Dadurch
stand eine deutlich größere Ausbeute an Antikörper in Form des Konjugates für
die folgenden Versuche zur Verfügung.
Aufgrund der Wasserunlöslichkeit der Retinolsäure diente zunächst DMSO als
Lösungsmittel. Es stellte sich heraus, dass die Retinolsäure in einer DMSOLösung
einer Konzentration, wie sie in Zellkulturen angewandt werden kann,
unzureichend löslich war. Deshalb wurde die Retinolsäure in Ethanol gelöst. Die
einmal in Ethanol gelöste Retinolsäure blieb auch bei weiterem Verdünnen in
Lösung. Die für die Kopplung benötigte und in Ethanol gelöste Retinolsäure
wurde in Konjugationspuffer MES aufgenommen.
Die Löslichkeit der Retinolsäure konnte zusätzlich verbessert werden, indem der
pH-Wert der Ethanollösung durch Zugabe von 1 n NaOH in 10 bis 20 µl-
Schritten zunächst angehoben und nach vollständiger Lösung der Retinolsäure
der ursprüngliche pH-Wert durch Hinzufügen von 1 n HCl wiederhergestellt
wurde.
*
*
*
* keine Sterilfiltration
durchgeführt
Ergebnisse 49
Ab Versuchsnummer 4 b fand die Trennung mit Hilfe des Filtrationskonzentrators
Centriprep statt. Dadurch konnte eine bessere Ausbeute an Antikörper
erzielt werden.
Bekannt ist, dass Proteine an Plastikoberflächen binden. Somit war ein Antikörperverlust
auch durch dessen Anheften an die Plastikwand der Reaktionsgefäße
denkbar. Ab Versuch Nummer Elf wurden deshalb vor der Antikörpertrennung
der Reinigungsfilter (Centricon) und der Zentrifugationsfilter (Centriprep)
mit dem Ziel des Coating der Gefäßoberfläche mit steriler BSA-Lösung
inkubiert. Danach konnte ein weiterer Anstieg der Ausbeute registriert werden.
Insgesamt trugen zur Steigerung der Ausbeute an Antikörper-Retinolsäure-
Konjugat bei:
- das Coating der Plastikoberfläche des Centriprep mit BSA vor dem Einfüllen
der Konjugatlösung,
- die Verwendung von Ethanol als Lösungsmittel für die Retinolsäure,
- das vollständigere Lösen der Retinolsäure nach Änderung des pH-Wertes
durch NaOH und HCl,
- die Optimierung des Verhältnisses zwischen eingesetzter Retinolsäure, EDC
und monoklonalem Antikörper sowie
- die Trennung von ungekoppeltem und gekoppeltem Antikörper durch einen
Zentrifugationsfilter anstatt über eine Gelfiltrationssäule.
6.2 In vitro-Testung der Konjugate
6.2.1 Konzentrationsbestimmung
Da die Proteinbestimmung nach Bradford auf der Reaktion des Farbstoffes
Servablue mit bestimmten Aminosäuren basiert, bestand die Gefahr, dass
Retinolsäuremoleküle gerade an diesen Stellen angekoppelt wurden und eine
Farbreaktion blockieren könnten. Deshalb wurde die Bestimmung der Antikörpermenge
mit dem Proteinnachweis nach Bradford mit der Methode nach
Lowry verglichen. Beide Nachweise wurden mit dem Standard BSA durchgeführt.
Ergebnisse 50
Mittels der Lowry-Methode waren zwar höhere Proteinkonzentrationen als mit
der Bradford-Methode nachweisbar, es resultierte jedoch etwa ein ähnliches
Verhältnis des nativen zu dem gekoppeltem Antikörper (Abb. 4).
Um die Anlagerung des monoklonalen Antikörpers an die Plastikoberfläche der
Zentrifugationsfilter zu reduzieren, wurden die Filter vor der Reaktion mit BSA
blockiert. Dadurch wären aber für die Methoden nach Lowry und nach Bradford,
die jeweils die Gesamtproteinbestimmung erlauben, und nicht mehrere Proteine
in einer Lösung unterscheiden können, falsch hohe Ergebnisse für die
Proteinkonzentration zu erwarten. Daraufhin wurde der monoklonale Antikörper
spezifisch mit einem ELISA gemessen. Die Ergebnisse dieses Nachweises waren
jedoch sehr different. Es ergab sich sowohl eine höhere als auch niedrigere
Proteinkonzentration als mit der Messung nach Lowry oder Bradford.
Mittels Extinktionsmessung wurde im Anschluß an die Trennung nach der
Kopplung die Konzentration der Retinolsäure in der Konjugatlösung bestimmt
(Abb. 6).
0 25 50 75 100 125
Konzentration der Retinolsäure (µg/ml)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Extinktion
???
?
?
?
?
?
?
?
Abb.6: Standardkurve für die Konzentrationsbestimmung der Retinolsäure
Ergebnisse 51
Daraus wurde die Menge der Retinolsäure berechnet und ins Verhältnis zu der
für den Versuch eingesetzten Retinolsäure gesetzt. Wie vollständig die
Anbindung der Retinolsäure an den Antikörper war, geht aus Abb. 7 hervor.
0 50 100 150 200 250 300 350
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Versuchsnummer
gekoppelte Retinolsäure (%)
Abb.7: Optimierung der EDC-Kopplung (Ausbeute an Retinolsäure)
Die Balken zeigen die Ausbeute an gekoppelter Retinolsäure im Verhältnis zur eingesetzten
Retinolsäure.
Insgesamt lag die Ausbeute im Mittel bei 136 %. Also erfolgte eine vollständige
Kopplung der eingesetzten Retinolsäure an den Antikörper.
6.2.2 Bindungsfähigkeit der Konjugate
Ein relevanter Unterschied im Bindungsverhalten an Neuroblastomzellen
zwischen dem gekoppelten und dem nativen Anitkörper stellte sich nicht
heraus (Abb. 8). Durch die Konjugation der Retinolsäure an den Antikörper
werden spezifische Bindungsstellen des Antikörpers offenbar nicht blockiert.
Ergebnisse 52
Abb.8: Bindungsfähigkeit der Immunkonjugate
Dargestellt ist das Verhältnis zwischen der Bindungsfähigkeit des Immunkonjugats und des
nativen Antikörpers an SK-N-MC-Zellen (n. d. = nicht durchgeführt)
Ziel der Experimente war, die Wirkung der Retinolsäure über monoklonale
Antikörper zu vermitteln. Also war die Bindung der Antikörper an Neuroblastomzellen
grundlegende Voraussetzung für die Versuche. Durch die Kopplung
bestand die Gefahr, dass spezifische Bindungsstellen des Antikörpers mit
Retinolsäure besetzt würden und dadurch die Bindungsfähgkeit reduziert
würde. Um einzuschätzen, wie stark dieser Einfluß auf die Erkennung des
Antigens der Neuroblastomzellen sein würde, wurde die Bindung von nativen
Antikörpern und von gekoppelten Antikörpern untersucht.
In einem Zell-ELISA wurde die Extinktion von möglichst gleichen
Konzentrationen beider Antikörper als ein Maß für die Antikörperbindung
verglichen. Die Konzentrationen der untersuchten Antikörper lagen abhängig
vom Versuch bei etwa 0,01 bis 100 µg/ml.
Die Extinktion des Konjugatantikörpers ergab Werte von 93 % bis 175 % im
Vergleich zum nativen Antikörper. Der Mittelwert aus allen Versuchen betrug
113 %. Der Unterschied war nicht signifikant.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Versuchsnummer
Bindungsfähigkeit nach der Kopplung (%)
n. d.
n. d.
n. d.
n. d.
n. d.
n. d.
n. d.
n. d.
Ergebnisse 53
6.2.3 Beeinflussung des Zellwachstums
Die Antikörper-Retinolsäure-Konjugate hemmten im Vergleich zu allen anderen
Proben das Zellwachstum signifikant (Abb. 9).
Konjugat A k+RA RA A k Ethanol Medium
Behandlung
0
20
40
60
80
100
120
140
Wa
chstum (%)
???
???
?
?
?????
n=36 n=31 n=39 n=26 n=34 n=21
Abb.9: Wachstum von SK-N-MC-Kulturzellen in Abhängigkeit von ihrer Behandlung
MTT-Test.
In den Boxplots sind Mediane dargestellt. Die Box umfaßt den Interquartilbereich mit 50 % aller
Werte. Die Linien führen jeweils zum niedrigsten und höchsten Wert, ohne Ausreißer zu
berücksichtigen. Ausreißer (o) liegen zwischen 1,5 und 3 Boxlängen vom oberen oder unteren
Rand der Box entfernt. Extremwerte (*) liegen mehr als drei Boxlängen außerhalb der Box.
Zusätzlich ist die Anzahl der Einzelwerte (n) angegeben, die in die Berechnung eingehen.
Die Proliferation betrug im Mittel nach Behandlung der Zellkultur mit Konjugat 47 %; mit
Antikörper-Retinolsäure-Gemisch (AK+RA) 79 %; mit Retinolsäure (RA) allein 80 %; mit dem
monoklonalen Antikörper allein (Ak) 89 %; mit Zellkulturmedium (Medium) 100 %; mit Ethanol
als Lösungsmittel der Retinolsäure 100 %. Das Zellwachstum war nach Inkubation mit dem
Konjugat im Vergleich zu allen anderen Testsubstanzen signifikant vermindert (p<0,001).
Anzahl n
Ergebnisse 54
Das Verhalten von Neuroblastomzellkulturen unter dem Einfluß der Immunkonjugate
war zu vergleichen mit dem Verhalten der Kulturen unter dem Einfluß
von Kontrollsubstanzen. Die Extinktion der Kultur im MTT-Test als Maß
mitochondrialer Aktivität, also von Lebensfähigkeit und Wachstum, wurde
verglichen. Die Kulturen wurden mit der unverdünnten Konjugatlösung
inkubiert. Als Kontrolle dienten gleiche Konzentrationen der anderen Testsubstanzen.
Die Ergebnisse wurden in Bezug zur Kontrollkultur mit dem
Lösungsmittel der Retinolsäure (Ethanol) oder mit Medium (= 100 %) gesetzt.
Behandlung
25
50
75
100
Wachst
um
(%)
Abb.10: Wachstum von SK-N-MC-Kulturzellen in Abhängigkeit von ihrer Behandlung und von
der nach der Kopplung verstrichenen Zeit
MTT-Test drei, neun und 28 Tage nach der Kopplung
Ak+RA
Tag 3
Ak+RA
Tag 9
Ak+RA
Tag 28
Konjugat
Tag 3
Konjugat
Tag 9
Konjugat
Tag 28
Ergebnisse 55
Drei, neun und 28 Tage nach der Kopplung wurde erneut ein MTT-Test mit
Konjugaten und ein Test mit ungekoppeltem Gemisch aus Antikörper und
Retinolsäure angesetzt, um die Stabilität der Peptidbindung im Immunkonjugat
zu überprüfen. Dazu wurden erneut die Proliferation nach Behandlung mit dem
ungekoppelten Gemisch und die Proliferation nach Konjugatbehandlung
miteinander verglichen (Abb. 10).
Es zeigte sich sowohl nach drei, nach neun als auch nach 28 Tagen nach der
Kopplung eine eindrucksvolle Proliferationshemmung durch das Konjugat, die
deutlich stärker ausfiel als nach Behandlung mit dem ungekoppelten Gemisch.
6.3 Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Modells
Makroskopisch waren die Tumoren regelmäßig erkennbar in Leber, Lymphknoten,
Bauchraum (am Peritoneum parietale und Peritoneum viscerale ohne
Infiltration in Organe) und Ovar (Abb. 11).
Abb.11: Disseminiertes Neuroblastom mit Lebermetastasen ( )
Als Disseminierung wurde das Anwachsen von Neuroblastomzellen in möglichst
vielen Organen angesehen. Die Bezeichnung lokale Tumoren galt für
diejenigen, welche nur im Bauchraum, also direkt durch die intraperitoneale
Zellapplikation, entstanden waren.
Ein reproduzierbares SCID-Maus-Modell für ein disseminiertes Neuroblastom
konnte aufgestellt werden (Tab. 1).
Ergebnisse 56
Tabelle 1: Etablierung eines Modells für ein disseminiertes Neuroblastom in der SCID-Maus
Befallene Organe
Anzahl
der Mäuse
(n)
Versuchsdauer
(Wochen)
Art der
Applikation
der Tumorzellen
Zellzahl je
Maus
(x106)
Leber
Niere
Lunge
Gehirn
Knochenmark
Intraabdominelle
Lymphknoten
Dünndarm
Ovar
Zwerchfell
3 4 i.p. 1
+ + +
+ + + + 3 5 i.p. 6,7
+ +
1 4 + + + +
1 5 + + + +
1 5
i.p. 10
+ + +
3 6 i.v. 5
2 6 i.v. 30
2 6
1 5 + +
1 8 + +
1 9 +
1 12
i.v. 50
1 7 + +
1 8 + + + +
1 12
i.p. + i.v. 50
+ + + +
In Lunge, Gehirn und Knochenmark gelang der Nachweis des Tumorwachstums
durch Anwachsen der Tumorzellen in der Zellkultur nach Kultivierung von
entsprechenden Organproben. Von der Tumordisseminierung waren somit
Leber, Lymphknoten, Bauchraum, Lunge, Ovar, Gehirn und Knochenmark
betroffen. Der Nachweis der Tumoren gelang nicht regelmäßig in allen
Versuchstieren in den gleichen Organen.
Bei alleiniger intraperitonealer Gabe von 1 x 106 Tumorzellen in einem Volumen
von 300 µl entstanden keine Tumoren. Nach Erhöhung der Tumorzellzahl auf
6,7 x 106 fanden sich Tumoren nur lokal im Bauchraum am Peritoneum, an den
Nieren, auf der Leberoberfläche und am Zwerchfell. Auch nach Erhöhung der
Zellzahl auf 10 x 106 bildeten sich Tumoren nur oberflächlich auf Bauchorganen,
eine Disseminierung trat nicht auf.
Ergebnisse 57
Deshalb wurde der Weg der intravenösen Applikation gewählt. Bei einer
Gesamtzellzahl von 5 x 106 und 30 x 106 traten keine Tumoren auf. Bei 50 x 106
Zellen fanden sich in drei von sechs Fällen Tumoren. In diesen drei Fällen
wuchsen aus entsprechenden Organproben in der Zelkultur in einem Fall
Tumorzellen aus dem Gehirn an, in einem weiteren Fall aus dem Knochenmark
und im dritten Fall aus der Lunge. Außerdem entstanden bei diesen Tieren in
zwei Fällen zusätzlich Tumoren am Ovar. Anhand dieses im Organismus
verteilten Auftretens der Tumoren, konnte eine Disseminierung gezeigt werden.
Da die Tumorentstehung nach intraperitonealer Zellapplikation nur lokal und
nach intravenöser Zellapplikation zwar disseminiert aber bei hoher Zellzahl nur
bei 50 % der Tiere induziert werden konnte, wurden anschließend intravenöse
und intraperitoneale Injektion der Tumorzellen kombiniert. Dazu erhielten die
Tiere unmittelbar nacheinander eine Hälfte der Zellsuspension von insgesamt
300 µl intravenös und die andere Hälfte intraperitoneal. Bei 50 x 106 Zellen pro
Versuchstier entstanden in allen drei Fällen Tumoren. Diese bildeten sich an
Ovar, Leber, abdominellen Lymphknoten, im Bauchraum, am Zwerchfell und im
Knochenmark.
Nach intraperitonealer Zellapplikation waren nach vier bis fünf Wochen
Tumoren entstanden, an den Mäusen äußerlich an tastbaren Schwellungen oder
Allgemeinsymptomen wie stumpfem Fell, Gewichtsverlust, gekräuseltem Fell
oder Lähmungen und bei der Präparation der getöteten Mäuse an makroskopischen
Tumoren erkennbar. Nach intravenöser Zellapplikation dauerte die
Tumorentstehung fünf bis zwölf Wochen. Nach kombinierter intravenöser und
intraperitonealer Gabe der Zellen dauerte die Tumorbildung sieben bis zwölf
Wochen.
Dieser Versuch war die Grundlage für die nachfolgenden therapeutischen
Tierversuche. Dazu wurden insgesamt Untersuchungen an 116 SCID-Mäusen
durchgeführt, denen zuvor SK-N-MC-Zellen appliziert worden waren. 78 Tiere
wurden präpariert und auf Tumorbefall untersucht. Bei 4 Mäusen war bei der
Präparation keinerlei Tumor nachweisbar. Somit war in 95 % der Versuchstiere
eine Tumorinduktion möglich.
Ergebnisse 58
Dabei traten in 47 Fällen (64 %) Tumoren in der Leber auf, bei 26 (35 %) in
der Milz, bei 19 (26 %) in der Niere, bei 19 (26 %) im Herz, bei 25 (34 %) in
der Lunge, in keinem Fall im Gehirn und bei 21 (28 %) im Knochenmark.
Als Begleiterscheinung des Tumorbefalls fiel wiederholt eine zum Teil blutige
Ascitesbildung auf (Abb. 12).
Abb.12: Blutiger Ascites bei einer SCID-Maus mit Tumoraussaat im Abdomen
Insgesamt konnte die Etablierung eines Modells für ein disseminiertes
Neuroblastom in der SCID-Maus als erfolgreich und reproduzierbar angesehen
werden.
6.4 Therapeutische Versuche / In vivo-Experimente
6.4.1 Letale Dosis der all- trans-Retinolsäure
Die therapeutische Dosierung von all- trans-Retinolsäure liegt bei Kindern bei
60 mg/m2. Zur Bestimmung der letalen Retinolsäuredosis verwendeten wir die
zehnfache Menge. Jedes Versuchstier erhielt dadurch 5 mg all- trans-Retinolsäure.
Alle drei Tiere überlebten (Tab. 2). Bei weiterer Verzehnfachung der
Dosis (50 mg/Versuchstier) starb eine Maus von sieben. Somit waren die Mäuse
bei der im Tierversuch zu erwartenden Retinolsäuredosis (maximal 30 µg pro
Versuchstier) nicht beeinträchtigt.
Ergebnisse 59
Tabelle 2: Letale Dosis der Retinolsäure
Applikationsart Applizierte Substanz Zahl der Mäuse Überlebende Mäuse
i. p. 50 mg RA 7 6
i. p. 5 mg RA 3 3
i. p. 10 % Ethanol 6 6
6.4.2 Beeinflussung des Tumorwachstums durch Immunkonjugate
Nach der Konjugatbehandlung lag der Medianwert der Tumormasse je
Versuchstier am niedrigsten, die Tumorzahl am zweitniedrigsten. Einige dieser
Ergebnisse waren statistisch signifikant.
Abbildung 13 zeigt ein Beispiel für jede Behandlungsform.
Abb.13: Tumorbefall ( ) nach Behandlung mit Konjugat (a), Ak+RA (b), RA (c), Ak (d), NaCl (e)
Es wurden jeweils 1 bis 2,5 x 107 Neuroblastomzellen der Linie SK-N-MC in
300 µl NaCl zu 50 % intravenös und 50 % intraperitoneal den Versuchstieren
injiziert (Tab. 3). Um in ein frühes Stadium der Tumorentstehung eingreifen zu
können, wurden die therapeutischen Testsubstanzen zwei bis drei Tage nach
der Tumorzellinjektion appliziert.
Im Verlauf der Untersuchungen der verschiedenen Testsubstanzen wurden 78
SCID-Mäuse präpariert. Von Organproben wurden Zellkulturen angelegt. Dabei
wuchsen Zellen in Proben von Leber, Milz, Niere, Herz, Lunge und Knochenmark
auf, was für die Disseminierung also den Erfolg des Modells spricht.
a) b) c) d) e)
Ergebnisse 60
Insgesamt wurden acht Tierversuche durchgeführt. Tumorwachstum und
Überlebenszeit wurden dabei in getrennten Experimenten untersucht. Tab. 3
gibt einen Überblick über die jeweiligen Versuchsbedingungen.
Die Testsubstanzen wurden im Tierversuch 1 und 2 einmalig, im Tierversuch 3
dreimalig, und ab dem vierten Tierversuch insgesamt sechsmal appliziert.
Tabelle 3: Versuchsbedingungen der Tierversuche
Die beobachtete Variable war entweder die Überlebensdauer (Versuche 6 und 7) der
Versuchstiere oder das Tumorwachstum (Tumormasse und Tumorzahl je Tier, Versuche 1 bis 5
und 8) nach Behandlung mit der angegebenen Testsubstanz.
Anzahl der Mäuse pro Testsubstanz (Testsubstanz je Versuchstier)
Nr.
Versuchsdauer
(d)
Applizierte
Tumorzellen
(x107)
Konjugat Ak+RA RA Ak
6 (Ak 50 µg; RA 3 µg)
1 34 2,5
6 (Ak 5 µg; RA 0,3 µg)
— 3 (3 µg) —
6 (Ak 25 µg; RA 0,9 µg)
2 38 1
6 (Ak 250 µg; RA 9 µg)
— 3 (9 µg) 3 (250 µg)
3 22 2 6 (Ak 200 µg; RA 3 µg) — — —
4 23 2 6 2) — — —
5 21 2 4 (Ak 119 µg; RA 23 µg) 4 (Ak 120 µg; RA 23 µg) 4 (23 µg) 4 (120 µg)
6 1) 1,8 4 (Ak 127 µg; RA 25 µg) 4 (Ak 127 µg; RA 25 µg) 4 (25 µg) 4 (127 µg)
7 1) 2 4 (Ak 96 µg; RA 23 µg) 4 (Ak 100 µg; RA 20 µg) 3 (20 µg) 4 (100 µg)
8 23 2 4 (Ak 109 µg; RA 30 µg) 4 (Ak 110 µg; RA 30 µg) 4 (30 µg) 4 (110 µg)
Tumorzellen wurden in einem Volumen von 300 µl zu je 50 % intravenös und intraperitoneal appliziert. Die jeweilige
Testsubstanz wurde in einem Volumen von 300 µl intraperitoneal verabreicht. Als Vergleich dienten 29 Mäuse, die mit
physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden.
1) Die Versuchsdauer hing im Abschnitt Überleben von der Lebensdauer der Tiere ab und kann dadurch nicht
einheitlich für alle Tiere angegeben werden.
2) In Versuch Nr. 4 wurde keine Angabe zur Konjugatmenge gemacht, siehe Diskussion (Erklärung zur Konzentrationsbestimmung
bei Kopplung Versuch Nr. 12).
Tiere, die nicht spontan verstarben, wurden bei Auftreten von Symptomen oder
nach Ablauf der Versuchsdauer durch Ether getötet und präpariert. Verstorbene
Tiere, bei denen bereits Prozesse der Autolyse eingetreten waren, wurden
wegen einer reduzierten Aussagekraft über das Vorhandensein von Tumoren
oder Metastasen nicht präpariert.
Ergebnisse 61
Aus den Tumormaßen wurde das Tumorvolumen berechnet. Aufgeschlüsselt
nach Behandlungsmethoden ist der Median des Tumorvolumens in Abb. 14
dargestellt.
Konjugat A k+RA RA A k NaC l
Behandlung
0
4
8
12
Tumormasse (g)
?
?
?
?
?
n=26 n=18 n=13 n=10 n=7
Abb.14: Tierversuch, Tumormasse in Abhängigkeit von der Behandlung
Der Median für die Tumormasse je Versuchstier beträgt nach Behandlung mit Konjugat 0,32 g;
dem ungekoppelten Gemisch aus Antikörper und Retinolsäure (Ak+RA) 1,50 g; Retinolsäure
allein (RA) 1,66 g; dem monoklonalen Antikörper allein (Ak) 1,71 g; physiologischer
Kochsalzlösung (NaCl) 1,79 g. Zwischen den Ergebnissen nach Konjugat- und nach RABehandlung
besteht ein statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05).
Die niedrigste Tumormasse wurde nach Behandlung mit dem Konjugat
ermittelt. Die Streubreite der Ergebnisse innerhalb einer Gruppe mit der
gleichen Behandlung ist hoch.
Anzahl n
Ergebnisse 62
Die Tumorzahl je Versuchstier in Abhängigkeit von der Behandlung geht aus
Abb. 15 hervor.
Konjugat A k+RA RA A k NaC l
Behandlung
0
5
10
15
20
Tumorzahl
?
???
?
n=26 n=18 n=13 n=10 n=7
Abb.15: Tierversuch, Tumorzahl in Abhängigkeit von der Behandlung
Der Median für die Zahl makroskopisch sichtbarer Tumoren je Versuchstier beträgt nach
Behandlung mit dem Konjugat 3,5; dem ungekoppelten Gemisch aus Antikörper und
Retinolsäure (Ak+RA) 3,0; Retinolsäure allein (RA) 6,0; dem monoklonalen Antikörper allein
(Ak) 5,0; physiologischer Kochsalzlösung (NaCl) 6,0. Zwischen den Ergebnissen nach Konjugat-
und nach NaCl- sowie nach RA-Behandlung besteht ein statistisch signifikanter Unterschied
(p<0,05).
Die niedrigste Tumorzahl mit 3,0 je SCID-Maus lag nach Behandlung mit dem
ungekoppelten Antikörper-Retinolsäure-Gemisch vor. Nach Behandlung mit dem
Konjugat lag die Tumorzahl bei 3,5.
Anzahl n
Ergebnisse 63
6.4.3 Postmortale Untersuchung der Versuchstiere
Immunzytologische Färbung / Differenzierungsgrad der Tumorzellen
Verschiedene Differenzierungsantigene konnten erhöht auf der Oberfläche der
konjugatbehandelten Tumorzellen nachgewiesen werden (Tab. 4). Dazu zählen
ICAM, NCAM, TGF-R und GFAP.
Tabelle 4: Nachweis von Differenzierungsantigenen auf den Tumorzellen in Abhängigkeit von
der Behandlung
APAAP-Färbung
Konjugat Ak+RA RA Ak NaCl
ICAM + - - - -
NCAM + - - - -
PECAM - - + - -
VCAM - - - - +
IGF-R - - - + -
TGF-R ++ - - - +
NF 68 - - - - -
NB 84 n. d. n. d. n. d. n. d. -
GD 2 n. d. n. d. - n. d. -
beta-Tubulin ++ + ++ ++ +
GFAP ++++ ++ ++ ++ ++
Negativkontrolle - - - - -
Dargestellt ist der Anteil der gefärbten Zellen nach der jeweiligen Behandlung. Die Anzahl der
gefärbten Zellen wurde verschlüsselt mit „-„ für 0 – 5%; „+“ für 6 – 25%; „++“ für 26 – 50%;
„+++“ für 51 – 75%; „++++“ für 76 – 100%.
Der Nachweis von NF68 und GD2 gelang im Median bei keiner Gruppe.
Die Negativkontrollen zeigten in keinem Fall eine Anfärbung.
Der Tierversuch Nummer Fünf konnte nicht mit APAAP ausgewertet werden, da
die Zellkultur für die mikroskopischen Präparate bakteriell kontaminiert und
somit eine Auswertung der Farbreaktion nicht möglich war.
Ergebnisse 64
Immunhistochemie
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung von Paraffinschnitten von
Tumoren, die bei der Präparation der SCID-Mäuse isoliert wurden, zeigt Tab. 5.
Tabelle 5: Immunhistochemie der Tumoren in Abhängigkeit von der Behandlung
Konjugat NaCl
Ki67 +++ +++
Chromogranin ++++ ++++
Synaptophysin - -
GFAP +++ -
Alpha-Internexin ++++ -
NF - -
S100 +++ -
Dargestellt ist der Anteil der gefärbten Zellen nach der jeweiligen Behandlung. Die Anzahl der
gefärbten Zellen wurde verschlüsselt mit „-„ für 0 – 5%; „+“ für 6 – 25%; „++“ für 26 – 50%;
„+++“ für 51 – 75%; „++++“ für 76 – 100%.
Der Proliferationsmarker Ki67 war nach Konjugatbehandlung unverändert stark
exprimiert. Auffallend war sowohl in der Kontrollgruppe, die mit Kochsalzlösung
behandelt wurde, als auch nach Konjugatbehandlung, dass es in allen
untersuchten Tumoren Areale mit hoher und niedriger Ki67-Exprimierung
nebeneinander gab (Abb. 16).
Abb.16: Anfärbbarkeit der Tumorzellen mit Anti-Ki67-Antikörpern nach NaCl-Behandlung (a)
und nach Konjugatbehandlung (b)
a) b)
Ergebnisse 65
GFAP, Alpha-Internexin und S100 waren im Vergleich zu Tumoren von
kochsalzbehandelten SCID-Mäusen jeweils deutlich stärker nach
Konjugatbehandlung auf der Zelloberfläche exprimiert (Abb. 17 a bis f). Die
stärkere Ausprägung konnte vor allem in den Tumorarealen mit niedriger Ki67-
Reaktivität beobachtet werden (Abb. 17 g und h).
a) b)
c) d)
e) f)
Ergebnisse 66
Abb.17: Anfärbbarkeit der Tumorzellen mit Anti-GFAP-Antikörper (a nach NaCl-Behandlung, b
nach Konjugatbehandlung), mit Anti-Alpha-Internexin-Antikörper (c nach NaCl-Behandlung, d
nach Konjugatbehandlung) und mit Anti-S100-Antikörper (e nach NaCl-Behandlung, f nach
Konjugatbehandlung) sowie der Vergleich der Anfärbbarkeit mit Anti-GFAP- (g) und Anti-Ki67-
Antikörper (h) im gleichen Schnitt nach Konjugatbehandlung
g) h)
Ergebnisse 67
6.4.4 Beeinflussung der Überlebenszeit durch Immunkonjugate
Die Überlebenszeiten der SCID-Mäuse sind in Form einer Kaplan-Meier-Kurve in
Abb. 18 gezeigt. Der Median der Überlebenszeit war nach Konjugatbehandlung
nicht niedriger als in den Kontrollgruppen.
Lebensdauer (Tage)
50 40 30 20 10 0
Kumulatives Überleben
1,2
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Behandlungsart
Konjugat
Ak+RA
RA
Ak
NaCl
Abb.18: Tierversuch, Überlebensdauer in Abhängigkeit von der Behandlung
Dargestellt sind die Überlebenskurven nach Behandlung der SCID-Mäuse mit den
Testsubstanzen. Die Überlebenszeit betrug im Median nach Behandlung mit dem Antikörper-
Retinolsäure-Konjugat (Konjugat) 25 Tage (n=8); mit dem ungekoppelten Gemisch aus
Antikörper und Retinolsäure (Ak+RA) 25 Tage (n=8); mit Retinolsäure allein (RA) 27 Tage
(n=7); mit dem monoklonalen Antikörper allein (Ak) 26 Tage (n=7) und mit physiologischer
Kochsalzlösung (NaCl) 25 Tage (n=8). Die Unterschiede sind statistisch nicht signifikant.
Diskussion 68
7 Diskussion
7.1 Konjugation von Retinolsäure und einem monoklonalen
Antikörper
Die Kopplung von all- trans-Retinolsäure an einen monoklonalen Antikörper
wurde bisher nicht beschrieben.
Die Kopplung konnte so optimiert werden, dass eine gute Ausbeute erreicht
wurde und die Bindungsfähigkeit der Antikörper-Retinolsäure-Konjugate an
Neuroblastomzellen nachweislich erhalten blieb.
Die Ausbeute von bis zu 80 % konnte nur durch aufwendige Optimierungsversuche
erreicht werden. Ursache für Verluste könnte trotz der Blockierung der
Oberfläche des Centripreps mit BSA eine Bindung des monoklonalen Antikörpers
an die Plastikoberfläche sein. Außerdem entstehen Verluste wahrscheinlich
direkt am Filter des Centripreps. Selbst nach ausgiebigem Waschen des Filters
mit steriler Kochsalzlösung im Anschluß an die Trennung sprach ein geringer
Farbumschlag einer auf den Filter aufgetragenen Bradfordlösung für die
Anwesenheit von Proteinen.
Nicht zuletzt ist die Genauigkeit der aus der Standardkurve errechneten
Proteinkonzentrationen und damit auch der Ausbeute aufgrund der hohen
Verdünnungsschritte bis 1:320 000 bei der Konzentrationsmessung begrenzt.
Bezogen auf die Körperoberfläche war die Dosis der all- trans-Retinolsäure in
den vorliegenden Versuchen maximal 3,6 mg/m2 je Gabe. Sie ist damit
niedriger als in der therapeutischen Anwendung bei am Neuroblastom
erkrankten Kindern, wo bis zu 60 mg/m2 Körperoberfläche je Dosis toleriert
werden (Smith et al., 1992). Dadurch dürfte jedoch kein grundsätzlicher
Nachteil des Konjugateinsatzes entstehen, da die Retinolsäure über den
Antikörper direkt an die Tumorzellen herangeführt, auf diese gezielter wirken
müßte und sich nicht wie in der oralen Therapie mit Retinolsäure allein auf den
gesamten Körper gleichmäßig verteilt.
Diskussion 69
Der Retinolsäureanteil im Konjugat hätte am ehesten durch den Einsatz von
mehr Retinolsäure im Verhältnis zum Antikörper erhöht werden können. Denn
da die Retinolsäure nahezu vollständig an den monoklonalen Antikörper
gekoppelt wird, ist naheliegend, dass am Antikörper noch Stellen zur Bindung
der Retinolsäure frei sind. Der Retinolsäureanteil ist jedoch gezielt reduziert
worden, nachdem hohe Retinolsäurekonzentrationen für die großen Verluste
während der Kopplung durch Präzipitation verantwortlich gemacht worden
waren.
Die Art der Bindung der Retinolsäure an den Antikörper wurde in unserem Fall
nicht untersucht und stattdessen nach der Auswertung vorliegender Publikationen
zum Thema angenommen. Bereits 1976 wurde von Jacobsen mittels
Spektrophotometrie, Gelfiltration und Gelelektrophorese die kovalente Natur der
Bindung zwischen Albumin und Bilirubin nach EDC-Kopplung gezeigt. Nyman et
al. (2002) gelang mittels Röntgenkristallographie der Nachweis einer kovalenten
Bindung zwischen den beiden Proteinen Profilin und Aktin nach EDC-Kopplung.
Muller et al. (2001) untersuchten mit Hilfe der EDC-Kopplung die Bestandteile
des mitochondrialen Steroidhydroxylasesystems und fanden Verbindungen
zwischen Aminosäuren. Dass die Kopplung zwischen Amino- und Carboxylgruppen
stattfindet, wurde von Valuev et al. (1998) gezeigt. In dieser Arbeit
wurden sowohl zwischen verschiedenen Proteinmolekülen als auch
intramolekulare Vernetzungen beschrieben.
Eine weitere offene Frage ist das Schicksal der Retinolsäure an oder in der Zelle
nach der Anbindung des monoklonalen Antikörpers an sein Antigen an der
Tumorzelloberfläche. Liegt die Retinolsäure einmal frei außerhalb der Zelle vor,
so kann davon ausgegangen werden, dass sie mit Hilfe der CRABPs zum Ort
ihrer Wirkung im Zellkern transportiert wird (Noy, 2000). Die Retinolsäure ist
durch eine Amidbindung an den Antikörper gebunden. Es wird vermutet, dass
die Aktivität von Proteasen, die in hoher Konzentration am Ort eines
Tumorgeschehens vorliegen, auch zur Freisetzung der Retinolsäure aus dem
Konjugat führt. Im Falle von Mitomycin C und N-succinyl-Chitosan, die durch
EDC-Kopplung gekoppelt wurden, konnte in vitro in Mausplasma die graduelle
Freisetzung des Mitomycin C gezeigt werden (Kato et al., 2000).
Diskussion 70
7.2 In vitro-Testung der Konjugate
7.2.1 Konzentrationsbestimmung
Zur Berechnung der Konzentration des Antikörpers vor und nach der Kopplung
kamen verschiedene Methoden zum Einsatz. Der Proteinnachweis erfolgte
zunächst mit der Bradford-Methode. In den ersten Kopplungsversuchen waren
mit dieser Methode hohe Proteinverluste aufgefallen.
Eine denkbare Ursache für die anfangs hohen Proteinverluste nach der EDCKopplung
waren Blockierungen an Stellen im Protein, die für den Bradford-
Nachweis frei sein müßten. Die Lowry-Methode wurde deshalb zum Vergleich
eingesetzt. Die relative Ausbeute an Antikörper nach der Kopplung war bei
beiden Nachweismethoden etwa gleich. Einerseits könnten die Aminosäuren für
den Lowry-Nachweis im gleichen Verhältnis blockiert sein wie die Aminosäuren
für den Bradford-Nachweis. Andererseits spricht das Ergebnis auch für einen
tatsächlichen Proteinverlust durch die Kopplungs- und Trennungsvorgänge als
nur einen scheinbaren Proteinverlust durch blockierte Nachweisgruppen.
Bei der Kopplung von Doxorubicin an murine monoklonale Antikörper mittels
EDC-Kopplung wurden ebenfalls Schwierigkeiten bei der Versuchsdurchführung
wegen Antikörperpräzipitationen und zusätzlicher Verluste bei der Sterilfiltration
des Konjugates beschrieben (Sinkule et al., 1991). Burstein und Knapp (1977)
berichteten über einen großen Anteil unlöslichen Antikörper-Methotrexat-
Konjugates nach EDC-Kopplung, der am ehesten durch Antikörperaggregation
verursacht war.
Die Konzentrationsoptima für die Meßmethoden (Bradford, Lowry, Zell-Elisa)
machten hohe Verdünnungen der zu vermessenden Lösungen bis 1:320 000
erforderlich. Dabei ist anzunehmen, dass allein die Streuung der Meßwerte und
ihre nachfolgende Rückrechnung auf die Originalkonzentrationen zu
fehlerhaften Angaben der Proteinkonzentrationen führten.
Diskussion 71
Die Farbintensität einer Retinolsäurelösung erwies sich als abhängig vom pHWert
der Lösung. Jedoch lag im Anschluß an die Kopplungsreaktionen durch die
Verwendung von physiologischer Kochsalzlösung als Lösungsmittel jeweils der
gleiche pH-Wert wie in der Retinolsäurelösung vor, die zur Aufstellung der
Eichkurve für die Retinolsäurekonzentration verwendet wurde. Durch Schwankungen
des pH-Wertes ist also kein verfälschender Einfluß auf die Bestimmung
der Retinolsäurekonzentration im Konjugat zu erwarten.
Ungeklärt ist jedoch die Frage, ob sich die Extinktion der Retinolsäure durch die
Kopplung an den monoklonalen Antikörper ändert. Um eine Antwort zu finden,
müßte die Konzentration der Retinolsäure direkt in der Konjugatlösung als
Standard dienen und nicht ungekoppelte Retinolsäurelösung.
In einzelnen Fällen fiel während der Optimierung der EDC-Kopplung eine
Ausbeute an gekoppeltem Antikörper von über 100 % auf. Scheinbar ergibt sich
also nach der Kopplung eine größere absolute Proteinmenge als vor der
Kopplung. Dieser Fehler ist am ehesten auf die bereits erwähnten nicht exakten
Verdünnungsschritte bei der Proteinbestimmung zurückzuführen.
Ungenauigkeiten beim Verdünnen könnten ebenso der Grund sein, dass in
manchen Versuchen scheinbar über 100 % der eingesetzten Retinolsäure im
Konjugat vorliegen. Darüberhinaus kann die Konzentration der Retinolsäure nur
eine gewisse Annäherung sein, da die Absorptionsmessung aus technischen
Gründen bei 405 nm und nicht bei der optimalen Absorptionswellenlänge der
all- trans-Retinolsäure von 340 nm erfolgte. Zumindest kann mit diesem
Verfahren eine minimale Interferenz durch Überschneidung mit dem
Absorptionsspektrum der Proteine erwartet werden, das um 280 nm liegt.
Die Antikörperausbeute im Versuch 12 erfordert eine eigene Erklärung. In
diesem Fall wurde mit der Methode des ELISA eine Ausbeute von 0,08 %
erreicht. In diesem Versuch wurde mit 5580 µg eine hohe absolute Menge an
Antikörper für die Kopplung eingesetzt. Außerdem sollte der relative
Retinolsäureanteil gesteigert werden. Im Vorversuch wurde Retinolsäure im
Verhältnis 1:100 zum Antikörper eingesetzt, hier im Verhältnis 1:10.
Diskussion 72
Die Kombination aus der hohen Konzentration an Retinolsäure und der hohen
Menge an Antikörper führte am ehesten im Rahmen der Kopplung und der
darauffolgenden Zentrifugation zum Verklumpen des Proteins, so dass es durch
die eingesetzten Nachweismethoden nicht erfaßt wurde. Hinweise, dass es nicht
zu einem tatsächlichen Verlust kam, sind der positive Retinolsäurenachweis im
Konjugat, der ohne die Kopplung an ein Protein im Anschluß an die
Zentrifugation nicht möglich wäre, und die deutlichen Ergebnisse bei Testung
des Konjugates im MTT-Test und im Tierversuch.
In nachfolgenden Versuchen wurde der Anteil der Retinolsäure wieder
reduziert. Um das Risiko einer Präzipitation der Konjugate so gering wie möglich
zu halten, muß in Kauf genommen werden, dass die Retinolsäure offenbar nicht
im Überschuß vorliegen kann.
7.2.2 Bindungsfähigkeit der Konjugate
Die Bindungsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers an die Oberfläche der
Neuroblastomzellen, wie sie im Zell-ELISA untersucht wurde, blieb durch die
Kopplung der Retinolsäure unbeeinträchtigt. Die Unterschiede in der Bindung
waren statistisch nicht signifikant. Auch bei der Kopplung von Indium-111 an
monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente zum Zweck der
Immundetektion von Tumorzellen konnte in ELISA-Tests die vollständig
erhaltene Immunreaktivität der radioaktiv markierten Antikörper gezeigt werden
(Bedel-Cloutour CH et al., 1991).
In drei Fällen lag der Quotient aus der Extinktion der Konjugatlösung und der
Extinktion der nativen Antikörperlösung als Maß für die Bindung an
Neuroblastomzellen im Zell-ELISA über 1,0. Das heißt, dass der
Konjugatantikörper scheinbar besser an die Neuroblastomzellen bindet als der
ungekoppelte Antikörper. Durch die Kopplung der Retinolsäure an den
monoklonalen Antikörper könnte höchstens eine Beeinträchtigung der Bindung
an Neuroblastomzellen erklärt werden und keine verbesserte Bindungsfähigkeit.
Das beschriebene Ergebnis ist am ehesten auf Berechnungen anhand von durch
Verdünnungsfehler verursachte ungenaue Werte zurückzuführen.
Diskussion 73
Die Retinolsäure wurde in den Kopplungsversuchen entsprechend der
Nachweismethode vollständig an den monoklonalen Antikörper angekoppelt.
Für eine effektivere Kopplung wäre ein deutlicher Überschuß an Retinolsäure
wünschenswert. Dadurch könnten möglichst viele Bindungsstellen am
Antikörper mit Retinolsäure besetzt werden, an der Zielzelle würde eine
entsprechend hohe Konzentration der Retinolsäure entstehen. Für die EDCKopplung
war im Verlauf der Optimierung jedoch eine Reduktion des relativen
Retinolsäureanteils erforderlich, um eine bessere Ausbeute an Kopplungsprodukt
zu erreichen. Darüberhinaus liegt die Molekülgröße des Konjugatantikörpers
durch die verhältnismäßig kleinen Retinolsäuremoleküle nicht
wesentlich über der des ungekoppelten Antikörpers. Native und gekoppelte
Antikörper werden dadurch in der Zentrifugation nicht voneinander getrennt.
Im Zell-ELISA kann nicht unterschieden werden, ob die Bindung an die
Neuroblastomzellen durch Konjugatantikörper oder ungekoppelten Antikörper
erfolgt.
Im Nachhinein läßt sich anhand der deutlichen Ergebnisse der in vitro-Versuche
zur Zellproliferation vermuten, dass durch die Kopplung ein relativ hoher Anteil
der möglichen Bindungsstellen am Antikörper auch tatsächlich mit Retinolsäure
besetzt wurde.
7.2.3 Beeinflussung des Zellwachstums
Die eindrucksvollen Ergebnisse des MTT-Tests zeigen, wie deutlich die
Proliferation in der Zellkultur nach Konjugatbehandlung im Vergleich zur
Behandlung mit den übrigen Proben reduziert wird.
Eine verminderte Proliferation im MTT-Test durch Apoptose nach der Inkubation
von SK-N-MC-Zellen mit Retinolsäure konnte bereits vorher gezeigt werden
(Voigt et al., 2000). Auch Konjugate aus Antidisialogangliosid und Ricin A
hemmten in vitro die Proteinsynthese um 50 % (Gottstein et al., 1994). Ein
Immunotoxin aus einem rekombinanten Anti-GD2-Antikörper und dem
Pseudomonas-Exotoxin A reduzierte in vitro den Anteil lebensfähiger Zellen der
Linie IMR5 um 50% (Tur et al., 2001).
Diskussion 74
Auch nach Kopplung des Anti-GD2-Antikörpers an Ricin A konnte in vitro die
Reduktion lebensfähiger Zellen der Linie IMR5-75 um 50 % gezeigt werden. Die
Wirkung hinsichtlich der Proliferationshemmung war von der Dosis des
Immunotoxins abhängig und wurde bei einer 3 x 10-9 M Lösung nach
24 Stunden und bei einer 1 x 10-11 M Lösung nach 96 Stunden erreicht (Manzke
et al., 2001).
Nach Durchführung des MTT-Test wurden die Zellkulturen bei uns nicht
weiterbeobachtet. Es gibt jedoch Berichte, dass die Inhibierung des
Zellwachstums vorübergehender Natur ist und nach Absetzen der Retinolsäure
wieder zunehmendes Zellwachstum auftritt, was bei SMS-KCNR-Zellen
beobachtet wurde. Bei SMS-LHN-Zellen hingegen, die zehn Tage in Kultur mit
Retinolsäure inkubiert wurden, waren die morphologische Differenzierung und
die verminderte Zellproliferation auch nach Absetzen der Retinolsäure nach
sechzig Tagen noch erhalten (Reynolds et al., 1991).
Ein ähnliches Phänomen wurde bei Zellkulturen von SH-SY5Y beobachtet. Hier
wurden LG69 (ein selektiver RXR-Agonist), 9- cis-Retinolsäure, all- trans-
Retinolsäure, Ethanol und DMSO verglichen. Fortsätze im Sinne von Neuriten
als Zeichen für neuronale Differenzierung bildeten am deutlichsten Zellen nach
Behandlung mit all- trans-Retinolsäure und 9- cis-Retinolsäure und weniger unter
LG69 oder den Kontrollsubstanzen. Nach Wegnahme der 9- cis-Retinolsäure
traten die Zellen in Apoptose. Nach Absetzen von LG69 und all- trans-
Retinolsäure kehrten sie zu ihrem original undifferenzierten Status zurück
(Irving, 1998). In einem anderen Fall fiel ebenfalls die Reversibilität der
Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen nach Entfernung der all- trans-Retinolsäure
auf. Hier wurde zusätzlich die unterschiedliche Reaktion der Zellkultur auf das
Inkubationsmuster mit 9- cis-Retinolsäure gezeigt. Dabei kam es nach
kontinuierlicher Inkubation nicht zu einer Apoptose. Diese ließ sich nur nach
fünftägiger Inkubation und anschließender Pause von 13 Tagen nachweisen
(Lovat et al., 1997).
Zukünftige Versuche könnten sich mit dem Verhalten von Kulturen von
SK-N-MC-Zellen nach der Wegnahme der Retinolsäure beschäftigen.
Diskussion 75
7.3 Etablierung eines SCID-Maus-Tumor-Modells
Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals ein reproduzierbares SCID-Maus-
Modell für ein disseminiertes Neuroblastom mit der Zelllinie SK-N-MC entwickelt
werden. Nach kombinierter intravenöser und intraperitonealer Injektion der
Tumorzellen konnten Neuroblastomzellen in Leber, Ovar, Milz, Lunge, Knochenmark
und in abdominellen Lymphknoten der Versuchstiere nachgewiesen
werden. In den Versuchen zur Etablierung des Tiermodells bildete sich nach
sieben bis zwölf Wochen ein symptomatisches Krankheitsbild heraus. Spätere
Versuche zur therapeutischen Testung des Modells ergaben bereits nach drei
Wochen einen ausgeprägten Tumorbefall bei den SCID-Mäusen.
Tumormetastasemodelle an der SCID-Maus mit anderen Zelllinien wurden
berichtet. Bogenmann (1996) beschrieb ein Modell, das mit der Neuroblastomzelllinie
HTLA230 aufgestellt worden war. Nach Injektion von mindestens
0,1 x 106 Zellen in einem Volumen von 300 µl in eine Schwanzvene bildeten
sich abdominelle Raumforderungen. Bei jeder Maus mit Tumorbildung konnten
auch Lebermetastasen nachgewiesen werden. Bei hoher Tumorlast waren
außerdem Absiedlungen in den Nebennieren, Knochenmark und Ovarien
nachweisbar, jedoch nie in der Lunge. Die Mäuse überlebten ohne Therapie drei
Wochen.
In unseren Experimenten waren mindestens 10 x 106 Zellen zur Tumorinduktion
erforderlich. Die Eigenschaften der einzelnen Zelllinien hinsichtlich Aggressivität
und Invasivität sind deutlich unterschiedlich, was die Abweichung in der nötigen
Gesamtzellzahl und damit auch im injizierten Volumen erklären kann. Der
häufige Knochenmarkbefall und die tumoröse Absiedlung in den Ovarien ähnelt
unserem Modell. Jedoch gelang uns in keinem Fall der Tumornachweis in den
Nebennieren, einer eher typischen Lokalisation des Neuroblastoms beim
Menschen, hingegen gelang Tumornachweis in der Lunge.
Ein unserem Modell ähnlicheres Befallsmuster wurde von Thompson et al.
(2001) beschrieben, nachdem SCID-Mäusen mindestens 1 x 105 Zellen der
Zelllinie NB-1691 in eine Schwanzvene injiziert worden waren. Dabei fielen
makroskopische Tumoren in der Leber, den Niere, Ovarien, den Nebennieren,
der Milz, Lunge, im Herz, in Lymphknoten und subkutan auf.
Diskussion 76
Ebenso wie in unseren Versuchen wurde ein oft hämorrhagischer Ascites bei
tumorbefallenen Mäusen beschrieben.
In einem SCID-Mausmodell mit der Neuroblastomzelllinie IMR5 konnte nach
Injektion von 10 x 106 Zellen bei vier von sechs Mäusen ein Knochenmarkbefall
gezeigt werden (Gottstein et al., 1994). In unserem Fall ließ sich in 28 % ein
Befall des Knochenmarks nachweisen.
Die Möglichkeiten der intravenösen Injektion waren in unseren Experimenten
durch die schwierige Punktion der seitlichen Schwanzvenen der Mäuse limitiert.
Bei einem Volumen über 150 µl kam es häufig zum Platzen der Vene. Die
gleiche Zellzahl in einem niedrigeren Gesamtvolumen aufzunehmen, hätte
jedoch eine deutlich viskösere Lösung mit zusätzlich erschwerten Injektionsbedingungen
bedeutet. Durch die kombinierte intravenöse und intraperitoneale
Zellinjektion konnte die Gesamtzellzahl zuverlässig appliziert werden.
7.4 In vivo-Experimente
Die ermittelte letale Dosis der Retinolsäure stellt keine Einschränkung des
Versuchs dar. Die Dosis, bei der ein Versuchstier verstarb, liegt weit über der im
Tierversuch eingesetzten Dosis.
Die Tumormasse je Tier war nach Behandlung mit dem Antikörper-Retinolsäure-
Konjugat am niedrigsten. Die Streubreite der Ergebnisse ist jedoch sehr hoch,
das Resultat ist statistisch nicht signifikant.
Die Tumorzahl war nach Behandlung mit dem ungekoppelten Gemisch aus
Retinolsäure und dem monoklonalen Antikörper am niedrigsten. Nach Konjugatbehandlung
war die Tumorzahl je Versuchstier etwas höher. Auch hier war die
Streubreite sehr hoch und die statistische Signifikanz entsprechend niedrig. Die
reduzierte Tumormasse ohne Einfluß auf die Tumorzahl könnte dafür sprechen,
dass das Wachstum der Tumorzellen durch die Konjugatbehandlung verzögert
wurde jedoch nicht unterbunden.
Diskussion 77
Bei den Mäusen, bei denen keinerlei Tumor bei Präparation nachweisbar war,
galten die Tumorzellen als nicht angewachsen, da aufgrund der vorliegenden
Ergebnisse nicht zu erwarten war, dass der Tumor durch die Behandlung völlig
zurückgedrängt werden konnte.
Bei Mäusen mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) konnte nach Behandlung
mit einem monoklonalen Antikörper gegen das common ALL Antigen, an den
Ricin A-Ketten gekoppelt waren, über vier tumorfreie von fünf behandelten
Mäusen berichtet werden. Ein Tier erlitt später einen Rückfall (Hara et al.,
1988). An Nacktratten wurde eine signifikante Reduktion der Tumormasse eines
0,3 ml großen subkutanen Tumors aus SH-SY5Y-Zellen nach oraler Therapie mit
Retinoiden gezeigt (Ponthan et al., 2001). Dramatische Antitumoreffekte sowohl
in SCID- als auch in immunologisch intakten tumortragenden Mäusen
(Neuroblastom-Xenograft, GD2 positiv) wurden nach Behandlung mit einem
Fusionsprotein aus IL2 und monoklonalen anti-GD2-Antikörpern beobachtet
(Sondel, Hank, 1997). Eine Reduktion des Tumors bis um 90 % bei Nacktratten
nach intraaortaler Injektion der Tumorzellen konnte durch natürliche humane
zytotoxische anti-Neuroblastom-IgM-Antikörper aus dem Serum gesunder
Personen erzielt werden (Engler et al., 2001).
Auch bei dem Versuch zur Ermittlung der Überlebenszeit ließen sich die in vitro
beobachteten signifikanten Ergebnisse nicht in vivo reproduzieren. Die
Überlebenszeit war nach Konjugatbehandlung nicht länger als in den
Kontrollgruppen.
Dagegen konnte die Überlebenszeit bei SCID-Mäusen nach intravenöser
Tumoretablierung (Zelllinie IMR5-75) durch die intraperitoneale Behandlung mit
Immunotoxinen aus anti-GD2-Antikörpern und Ricin A-Ketten signifikant
verlängert werden (Manzke et al., 2001). Auch bei SCID-Mäusen mit einem
Tumor einer humanen B-Leukämie-Lymphom-Zelllinie BALL-1 war das
Überleben nach intraperitonealer Gabe eines Konjugates aus dem monoklonalen
Antikörper SN7 und Ricin A-Ketten signifikant verlängert (Kawata et al., 1994).
Die Frage, warum derartige eindeutige in vivo-Ergebnisse nicht mit
Immunokonjugaten aus dem monoklonalen Antikörper 15/7 und all- trans-
Retinolsäure erreicht werden konnten, kann nicht endgültig geklärt werden.
Diskussion 78
Die 9,5fache Anreicherung des Antikörpers 15/7 im Vergleich zu anderen
Organen konnte bereits nach Kopplung an I-131 gezeigt werden (Voigt et al.,
1997). Andererseits wurde wie bereits erwähnt nach Inkubation mit all- trans-
Retinolsäure beobachtet, dass Neuroblastomzellen der Linie SH-SY5Y wieder in
ihren ursprünglichen undifferenzierten Zustand zurückkehren, sobald die
Retinolsäure von der Kultur entfernt wird (Irving, 1998). Demzufolge könnte
eine Tumorreduktion, die unter den Konjugatapplikationen eintreten würde, in
der Zeit zwischen der letzten Konjugatapplikation und der Präparation der
Versuchstiere bereits wieder rückläufig gewesen sein.
Eine weitere Limitierung erfahren die Tierversuche sicher durch die niedrige
Anzahl an Versuchstieren.
Die Expression einzelner Adhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktorrezeptoren
auf der Zelloberfläche war nach Konjugatbehandlung höher als in den Kontrollgruppen.
Dazu zählen ICAM, NCAM und TGF-R. Entsprechend früheren
Versuchen wäre eine weitreichendere Zunahme der Expression als Zeichen für
einen erhöhten Reifegrad der Tumorzellen zu erwarten gewesen. In vitro war
gezeigt worden, dass SK-N-MC-Zellen nach Retinolsäureeinwirkung eine
deutlich vermehrte Expression von ICAM, NCAM, PECAM, VCAM und IGF-R
aufweisen und vermehrt NF68 exprimieren. NGF und TGF-R blieben etwa
unverändert (Voigt et al., 2000). In diesem Maß konnte die Differenzierung der
Tumorzellen in den Tierversuchen nicht reproduziert werden.
Zu den bereits erwähnten Problemen kommt außerdem eine Heterogenität der
verwendeten Zelllinie, die im Verlauf ein zunehmend entdifferenziertes
Wachstum in der Zellkultur zeigte und somit auch ein aggressiveres Wachstum
in vivo erklären könnte. Auffallend war auch die insgesamt niedrigere
Anfärbbarkeit der Tumorpräparate in den APAAP-Tests in späteren Versuchen.
Diese spontane Transformation und steigende proliferative Aktivität von Zellen
in der Kultur nach wiederholter Passage wurde von Rubin et al. (1990) an
embryonalen Mauszellen beschrieben. Eine epitheliale Hamsterzelllinie zeigte
mit zunehmender Passagenzahl ein schnelleres Wachstum und eine höhere
Zelldichte in der Kultur (Peiser et al., 1993).
Diskussion 79
Matsumura und Kawamoto (1994) beschrieben an einer humanen Gliomzelllinie
das Phänomen einer steigenden proliferativen Aktivität der passagierten Zellen
in Kultur im Vergleich zu den ursprünglichen Tumorzellen. Somit kann eine
höhere Aggressivität des Zellwachstums im Verlauf der Versuche eine Ursache
für die geringere Beeinflußbarkeit der Tumoren durch die Konjugatbehandlung
sein.
Immunhistochemische Untersuchungen von Paraffinschnitten der Tumoren
konnten die Differenzierung auslösende Wirkung der Antikörper-Retinolsäure-
Konjugate unterstützen. Im Vergleich zu mit kochsalzbehandelten Tumoren war
S100 nach Konjugatbehandlung stärker exprimiert. S100-Positivität ist ein
Charakteristikum von Schwannzellen sowie deren Vorläuferzellen und eine der
Eigenschaften, die bei Neuroblastomen für eine günstigere Prognose spricht
(Shimada et al., 1985). Mit zunehmender Reifung eines Neuroblastoms steigt
der Anteil an Schwannzellstroma (Shimada et al., 1999a). Auch der immunhistochemische
Nachweis von GFAP im Tumor fiel nach der Konjugatbehandlung
stärker aus. GFAP wird ebenfalls von Schwannzellen exprimiert und
im Rahmen der Reifung des Neuroblastoms hochreguliert (Scarpa et al., 1996).
Dafür spricht auch die stärkere Nachweisbarkeit von GFAP in Ganglioneuromen
im Gegensatz zu Neuroblastomen und Ganglioneuroblastomen (Molenaar et al.,
1990). Alpha-Internexin hingegen, dessen Nachweisbarkeit nach Konjugatbehandlung
ebenfalls deutlich anstieg, ist ein neuronenspezifisches Intermediärfilament
(Ho, Liem, 1996). Im Verlauf der Tumordifferenzierung nimmt die
Immunreaktivität für Alpha-Internexin zu. Somit scheint eine Reifung der
Tumoren durch die Therapie mit dem Antikörper-Retinolsäure-Konjugat
einzutreten. Erst in einer weiteren Entwicklungsstufe tritt das Intermediärfilament
NF auf (Shea, Beermann, 1999). In unserem Fall war NF auch nach
Konjugatbehandlung nicht nachweisbar, was offensichtlich für eine unvollendete
Tumorzellreifung spricht. Interessant ist, dass Ki67 sowohl mit als auch ohne
Konjugatbehandlung sehr stark exprimiert wird. Alle untersuchten Tumoren
besitzen jedoch Areale hoher als auch niedriger Ki67-Reaktivität gleichzeitig. Da
die Ausprägung von Ki67 den Anteil der proliferienden Tumorzellen anzeigt
(Schluter et al., 1993), wird das Ausmaß der Proliferation im Neuroblastom
durch das Konjugat offenbar nicht beeinflußt.
Diskussion 80
Erwähnenswert ist hierbei, dass die veränderte Exprimierung von Alpha-
Internexin, GFAP und S100 vor allem in den Arealen mit niedriger Ki67-
Ausprägung zu beobachten war, welches die Tatsache einer erfolgten
Differenzierung bestärkt.
Obwohl die Anreicherung des Antikörpers 15/7 im Tumor bereits gezeigt wurde,
kann die Tumorpenetration durch Präzipitationen als Folge der Retinolsäurekopplung
eingeschränkt sein. Das Problem der Molekülgröße und der niedrigen
Tumordurchdringung im Einsatz monoklonaler Antikörper in der onkologischen
Therapie wurde bereits beschrieben. Darüberhinaus sind die entsprechenden
Antigene auf den Tumorzellen heterogen exprimiert, wodurch sich einzelne
Zellverbände der Antikörperwirkung von vornherein entziehen (Weiner, 1999).
Das Tiermodell kann kaum eine Vorhersage treffen, wie toxisch sich der antihumane
monoklonale Mausantikörper im menschlichen Wirt verhalten würde.
Außerdem können Antitumoreffekte, die auf immunologischen Prozessen
basieren, in experimentellen Systemen wie der SCID-Maus nicht erreicht
werden. Die Tumorzellen könnten der Abwehr durch Antigenmodulation,
immunphänotypische Heterogenität und einer niedrigen Immunogenität der
Tumorzellen entgehen (Bodey et al., 2000).
Eine weitere ernstzunehmende Limitierung von Studien über antikörperbasierte
Therapien in SCID-Maus-Tumor-Modellen ist deren Mangel an normalem
humanen Gewebe, um einer Kreuzreaktivität und Toxizität der Antikörper auf
den Grund gehen zu können. Der Mangel an humaner Mikroumwelt bei den
SCID-Maus-Modellen ist auch deshalb ein Verlust, da sie dafür bekannt ist, eine
entscheidende Rolle bei der Regulierung von Tumorwachstum und
Metastasierung sowie bei der Antwort auf eine Immuntherapie zu spielen
(Bankert et al., 2001).
Wie von Bankert et al. (2001) empfohlen, beschränkte sich unsere Auswertung
nicht auf die bloße Messung von Tumorvolumen und Metastasenzahl sondern
schloß Veränderungen der immunologischen Tumorzelleigenschaften als
Antwort auf die therapeutischen Interventionen ein.
Schlußfolgerungen 81
8 Schlußfolgerungen
In der vorliegenden Arbeit wird erstmals die Kopplung von Retinolsäure an
einen monoklonalen Antikörper, den anti-Neuroblastom-Antikörper 15/7,
beschrieben. Die überzeugenden Ergebnisse aus den Untersuchungen an
SK-N-MC-Zellkulturen und die Resultate aus den Versuchen am selbst
etablierten SCID-Maus-Modell sind als Ausgangspunkt für weitere vertiefende
Experimente zu sehen.
Die Kopplung von all- trans-Retinolsäure und dem monoklonalen Antikörper 15/7
konnte mit der Carbodiimid-Methode erfolgreich durchgeführt werden. Die
Bindungsfähigkeit der Antikörper an die Kulturzelllinie SK-N-MC blieb durch die
Kopplung unbeeinträchtigt. In vitro konnte durch das Kopplungsprodukt eine
ausgeprägte Wachstumshemmung erreicht werden. In vivo zeigte sich am
erfolgreich etablierten SCID-Maus-Tumormodell zum Teil eine signifikante
Reduktion des Tumorwachstums, das Überleben der Versuchstiere wurde nicht
beeinflußt. Im APAAP-Test und in histochemischen Untersuchungen ließ sich
eine stärkere Ausreifung der Tumorzellen nach Behandlung der Versuchstiere
mit dem Immunkonjugat zeigen.
Die eindrucksvollen Ergebnisse aus den in vitro-Experimenten ließen sich
teilweise in vivo reproduzieren. Diese Resultate sind es wert, unter veränderten
Versuchsbedingungen weiter untersucht zu werden. Dazu zählt unter anderem
eine größere Versuchstierzahl. Außerdem könnte die Verwendung von
Antikörperfragmenten anstelle der nativen monoklonalen Antikörper zu einer
besseren Tumorpenetration der Immunkonjugate und einer rascheren Systemclearance
führen. So wäre das therapeutische Fenster für das in vitro hoch
potente Immunkonjugat optimierbar, da das kleinere Molekül rascher von
normalen Organen ausgeschwemmt würde.
Schlußfolgerungen 82
Zusätzliche Einsichten könnten außerdem gewonnen werden, wenn der Weg
der an den Antikörper gebundenen Retinolsäure in die Zelle und in der Zelle
genauer definiert wäre.
Neue Erkenntnisse lassen eine zusätzliche Verbesserung der Ergebnisse durch
Ersatz der all- trans- durch 9- cis-Retinolsäure erwarten, die im Gegensatz zur
all- trans-Form des Moleküls ihre Wirkung über beide zelluläre
Retinolsäurerezeptoren (RARs und RXRs) vermittelt und nicht nur über die
RARs.
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Abbildungsverzeichnis 92
10 Abbildungsverzeichnis
Abb.1: Formel für all- trans-Retinolsäure..................................................... 27
Abb.2: Formel für EDC.............................................................................. 28
Abb.3: Reaktionsgleichung für die EDC-Kopplung ....................................... 30
Abb.4: Optimierung der EDC-Kopplung (Ausbeute an Antikörper)................ 46
Abb.5: Verluste an Antikörper-Retinolsäure-Konjugat durch die
Sterilfiltration................................................................................. 48
Abb.6: Standardkurve für die Konzentrationsbestimmung der Retinolsäure .. 50
Abb.7: Optimierung der EDC-Kopplung (Ausbeute an Retinolsäure) ............. 51
Abb.8: Bindungsfähigkeit der Immunkonjugate .......................................... 52
Abb.9: Wachstum von SK-N-MC-Kulturzellen in Abhängigkeit von ihrer
Behandlung ................................................................................... 53
Abb.10: Wachstum von SK-N-MC-Kulturzellen in Abhängigkeit von ihrer
Behandlung und von der nach der Kopplung verstrichenen Zeit ....... 54
Abb.11: Disseminiertes Neuroblastom mit Lebermetastasen ........................ 55
Abb.12: Blutiger Ascites bei einer SCID-Maus mit Tumoraussaat im
Abdomen ..................................................................................... 58
Abb.13: Tumorbefall ................................................................................. 59
Abb.14: Tierversuch, Tumormasse in Abhängigkeit von der Behandlung....... 61
Abb.15: Tierversuch, Tumorzahl in Abhäniggkeit von der Behandlung .......... 62
Abb.16: Anfärbbarkeit der Tumorzellen mit Anti-Ki67-Antikörpern ............... 64
Abb.17: Anfärbbarkeit der Tumorzellen in der Immunhistochemie ............... 66
Abb.18: Tierversuch, Überlebensdauer in Abhängigkeit von der
Behandlung................................................................................ 67
Tabellenverzeichnis 93
11 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Etablierung eines Modells für ein disseminiertes Neuroblastom
in der SCID-Maus.......................................................................... 56
Tab. 2: Letale Dosis der Retinolsäure......................................................... 59
Tab. 3: Versuchsbedingungen der Tierversuche ......................................... 60
Tab. 4: Nachweis von Differenzierungsantigenen auf den Tumorzellen
in Abhängigkeit von der Behandlung .............................................. 63
Tab. 5: Immunhistochemie der Tumoren in Abhängigkeit von der
Behandlung .................................................................................. 64
Anhang 94
12 Anhang
Rohdaten der Experimente
EDC-Kopplung
Tab. 1: Eigenschaften der Versuchsanordnung für die Optimierung der EDC-Kopplung
(* Empfehlung des Herstellers, 1) pH-Wert-Einstellung mit NaOH und HCl)
Nr. des
Versuches
Ak nativ
(µg)
RA
(µg)
RA gelöst in
EDC
(µg)
Proteinnachweis
* 1000-2000 MES 1000
Trennung durch Gelfiltration
1 400 1000 DMSO 1000 Bradford
2 400 50 Ethanol 500 Bradford
3 400 50 Ethanol 5 Bradford
4a 410 50 Ethanol 5 Bradford
Trennung durch Zentrifugation (Centriprep)
4b 410 50 Ethanol 5 Bradford
5a 760 10 Ethanol1) 5 Bradford
5b 1800 10 Ethanol1) 5 Lowry
6a 625 10 Ethanol1) 5 Bradford
6b 1730 10 Ethanol1) 5 Lowry
7 520 10 Ethanol1) 5 Bradford
8 1987 20 Ethanol1) 10 Bradford
9 1540 20 Ethanol1) 10 Bradford
10 2000 20 Ethanol1) 10 ELISA
11 4800 50 Ethanol1) 25 ELISA
12 5580 558 Ethanol1) 280 ELISA
13a 720 78 Ethanol1) 39 Bradford
13b 625 78 Ethanol1) 39 ELISA
14a 3420 360 Ethanol1) 180 Bradford
14b 2290 360 Ethanol1) 180 ELISA
15a 7320 740 Ethanol1) 370 Bradford
15b 7320 740 Ethanol1) 370 ELISA
16a 6750 650 Ethanol1) 330 Bradford
16b 4500 650 Ethanol1) 330 ELISA
17a 7200 800 Ethanol1) 400 Bradford
17b 2900 800 Ethanol1) 400 ELISA
Anhang 95
Tab. 2: Technische Bedingungen der Versuche zur Optimierung der EDC-Kopplung
Nr.
Ak nativ
(µg/ml)
Ak nativ
(µl)
Ak nativ
(µg)
Ak im
Konjugat
(µg/ml)
Ak im
Konjugat
(µl)
Ak im
Konjugat
(µg)
Ak im Konjugat /
Ak nativ
(%)
Ak sterilfiltriert /
Ak nativ
(%)
Trennung durch Gelfiltration
1 400 1000 400 135 1000 135 34 3
2 400 1000 400 182 700 127 32 1
3 400 1000 400 116 500 58 15 3
4a 1370 600 820 152 1000 152 37 Keine
Sterilfiltration
Trennung durch Zentrifugation (Centriprep)
4b 1370 600 820 184 1000 184 45 Keine
Sterilfiltration
5a 1092 700 760 177 1000 177 23 5
5b 2560 700 1800 572 1000 572 32 Keine
Sterilfiltration
6a 625 1000 625 353 1100 390 62 11
6b 1730 1000 1730 1016 1100 1118 65 12
7 740 700 520 370 1000 370 71 Keine
Sterilfiltration
8 1242 1600 1987 336 2000 672 34 Keine
Sterilfiltration
9 2560 600 1540 2500 2000 5000 325 Keine
Sterilfiltration
10 1000 2000 2000 880 2000 1760 88 Keine
Sterilfiltration
11 1020 4700 4800 867 5000 4335 90 Keine
Sterilfiltration
12 1050 5300 5580 0,4 11000 4,4 0,08 Keine
Sterilfiltration
1200 600 720 1100 650 715 99 Keine
Sterilfiltration 13
1040 600 625 760 650 495 79 Keine
Sterilfiltration
1900 1800 3420 470 9100 4200 123 Keine
Sterilfiltration 14
1270 1800 2290 224 9100 2040 89 Keine
Sterilfiltration
1830 4000 7320 424 9000 3820 52 Keine
Sterilfiltration 15
1830 4000 7320 640 9000 5760 79 Keine
Sterilfiltration
1350 5000 6750 333 9000 3000 44 Keine
Sterilfiltration 16
900 5000 4500 750 9000 6750 65 Keine
Sterilfiltration
2400 3000 7200 362 8000 2900 40 Keine
Sterilfiltration 17
960 3000 2900 637 8000 5100 159 Keine
Sterilfiltration
Anhang 96
Tab. 3: Einsatz und Ausbeute der Retinolsäure bei der EDC-Kopplung
Nr. des
Versuches
RA nativ
(µg)
RA im Konjugat
(µg/ml)
Konjugat
(ml)
RA im Konjugat
(µg)
Ausbeute RA
(%)
7 10 9 1 9 9
8 20 17 2 34 170
9 20 28 2 56 25
10 20 30 2 60 300
11 50 13 5 65 130
12 558 89 11 980 180
13 78 122 0,65 79 100
14 360 76 9,1 690 190
15 740 84 9 756 100
16 650 77 9 693 110
17 800 102 8 810 100
Anhang 97
In vitro-Versuche
Tab. 4: Wachstum von SK-N-MC-Kulturzellen in Abhängigkeit von ihrer Behandlung
MTT-Test nach Inkubation mit der jeweiligen Testsubstanz, gemessen am Tag der Kopplung
Medium (%) Ethanol (%) RA (%) Ak (%) Ak+RA (%) Konj. (%)
102,99 94,44 97,42 92,69 67,05 75,25
96,04 104,34 68,77 111,49 63,61 78,86
100,97 101,23 79,94 92,69 62,18 76,45
99,00 95,07 75,64 94,98 64,47 71,62
103,68 107,12 74,21 108,36 62,46 32,18
97,32 97,81 76,79 93,65 64,18 31,62
99,04 100,13 92,18 78,71 83,69 77,55
97,22 98,58 91,89 78,19 92,74 82,85
103,74 101,29 89,63 79,76 88,50 72,45
96,92 102,50 74,25 89,30 76,16 36,64
100,13 102,87 74,25 88,70 74,79 26,94
102,94 94,63 87,95 100,74 73,15 41,38
99,15 104,43 83,83 29,53 89,46 21,55
96,13 104,67 83,05 27,82 87,90 59,06
104,72 90,90 83,64 25,89 81,50 50,75
116,41 102,97 86,03 114,87 33,94 61,70
111,91 93,87 87,31 136,21 54,00 64,15
71,68 103,16 87,68 108,19 53,03 4,16
100,99 105,75 62,42 109,05 53,61 4,49
96,16 97,85 63,13 98,30 118,13 4,32
102,85 96,41 49,37 95,47 117,41 4,49
100,00 107,73 70,65 87,74 113,47
101,28 92,27 73,55 93,47 86,71
98,54 99,95 73,55 89,65 100,48
93,97 99,95 101,26 91,81 91,79
95,04 99,20 92,10 95,63 83,33
106,25 100,89 92,46 87,20
104,96 86,36 65,94 92,83
99,43 93,39 70,77 84,76
96,98 114,47 62,08 78,39
99,62 105,78 40,58 76,56
103,96 89,08 77,67
100,96 94,33 76,56
94,80 94,89 81,74
101,46 87,20
102,79 84,51
88,77
86,92
80,07
Anhang 98
Tab. 5: Wachstum von SK-N-MC-Kulturzellen in Abhängigkeit von ihrer Behandlung
MTT-Test nach Inkubation mit der jeweiligen Testsubstanz, gemessen nach drei, acht und 28
Tagen nach der Kopplung
Tag nach Kopplung Behandlung der Kultur
Proliferation
(%)
Median der Proliferation
(%)
45
33
51
Konjugat
27
39
96
111
101
3
Ak+RA
92
99
21
21
21
Konjugat
21
21
102
100
97
9
Ak+RA
101
100
24
23 Konjugat
22
23
102
104
94
28
Ak+RA
100
101
Anhang 99
In vivo-Versuche
Tab. 6: Tierversuch, Tumormasse und Tumorzahl.
Tumormasse und Tumorzahl je Versuchstier in Abhängigkeit von der Behandlung. Die Nummer
(x/y) setzt sich zusammen aus der Nummer des Tierversuches x und der Nummer des
Versuchstiers y.
Konjugat Ak+RA-Gemisch Retinolsäure Antikörper NaCl
Nr.
Masse
(g)
Zahl Nr.
Masse
(g)
Zahl Nr.
Masse
(g)
Zahl Nr.
Masse
(g)
Zahl Nr.
Masse
(g)
Zahl
2/1 3,09 5 5/1 0,13 1 1/1 0,69 22 2/1 2,14 6 1/1 1,79 11
2/2 7,56 5 5/2 2,07 8 1/2 4,21 17 2/2 1,31 3 1/2 0,44 7
2/3 3,38 8 5/3 0,43 6 1/3 0,19 7 2/3 5,10 5 2/1 6,59 6
2/4 6,00 1 5/4 1,64 10 2/1 5,10 4 5/2 0,22 7 2/2 3,01 6
2/5 2,58 4 8/2 1,50 3 2/2 9,29 5 5/3 1,20 9 3/1 1,79 18
2/6 5,68 8 8/3 0,28 1 2/3 1,66 4 5/4 0,34 8 3/2 4,70 21
3/1 1,17 4 8/4 6,00 1 5/1 1,27 16 8/1 1,00 4 3/3 4,44 20
3/2 2,14 14 5/2 0,46 2 8/2 2,10 3 3/4 0,35 12
3/3 1,34 3 5/3 0,40 3 8/3 2,12 5 4/1 0,01 3
3/4 0,01 3 8/1 3,76 6 8/4 11,12 3 4/2 0,08 6
3/5 0,11 5 8/2 5,99 8 5/1 0,45 6
3/6 0,01 1 8/3 1,45 2 5/2 1,02 8
4/1 0,02 9 8/4 4,19 7 5/3 0,10 4
4/2 0,32 1 5/4 0,26 9
4/3 0,00 5 8/1 2,00 3
4/4 0,02 2 8/2 2,81 1
4/5 0,00 7 8/3 7,69 2
4/6 0,02 1 8/4 13,41 3
5/1 0,02 1
5/2 0,08 6
5/3 0,65 2
5/4 0,33 2
8/1 0,00 2
8/2 0,00 1
8/3 2,03 3
8/4 4,10 4
Anhang 100
Tab. 7: Tierversuch, Metastasierung.
Metastasierung der Tumoren je Versuchstier in Abhängigkeit von der Behandlung. Die Nummer
(x/y) setzt sich zusammen aus der Nummer des Tierversuches x und der Nummer des
Versuchstiers y.
Maus Leber Milz Niere Herz Lunge Gehirn KM Einzelne Tumoren
Konjugat
2/1 + + +
2/2 + + + + +
2/3 + +
2/4 +
2/5 + +
2/6 + + + + + +
3/1 +
3/2 + + + + + +
3/3 + + + + +
3/4 + +
3/5 + + + + +
3/6 +
4/1 + +
4/2 +
4/3 + +
4/4 +
4/5 + +
4/6 +
5/1 +
5/2 + +
5/3 +
5/4 +
8/1 + +
8/2 +
8/3 + + + + +
8/4 + + + + + + +
Ak+RA
5/1 +
5/2 + +
5/3 + +
5/4 + +
8/1 Kein Tumorwachstum
8/2 + + +
8/3 + + +
8/4 + + + +
Anhang 101
Maus Leber Milz Niere Herz Lunge Gehirn KM Einzelne Tumoren
RA
1/1 + + + +
1/2 + + +
1/3 +
2/1 + +
2/2 + + + + +
2/3 + +
5/1 + +
5/2 +
5/3 + +
5/4 Kein Tumorwachstum
8/1 + + + +
8/2 + + + + + + +
8/3 + + + +
8/4 + + + + + + +
Ak
2/1 + + + + + + +
2/2 +
2/3 + + + + + + +
5/1 Kein Tumorwachstum
5/2 + +
5/3 + +
5/4 + +
8/1 + + + + + +
8/2 + + + + +
8/3 + + + + +
8/4 + + + + +
NaCl
1/1 + + +
1/2 + +
2/1 + + + + + +
2/2 + + +
3/1 + + + +
3/2 + + + +
3/3 +
3/4 + +
4/1 + +
4/2 + +
4/3 Kein Tumorwachstum
5/1 + +
Anhang 102
Maus Leber Milz Niere Herz Lunge Gehirn KM Einzelne Tumoren
5/2 + +
5/3 + +
5/4 + +
8/1 + + + + + +
8/2 + + + + + +
8/3 + + + +
8/4 + + + + + + +
ALLE
78 47 26 19 19 25 0 21 72
„+“ steht zum einen für makroskopisch nachweisbaren Tumor entweder in den genannten
Organen oder im Bauchraum, ohne einem speziellen Organ zugeordnet werden zu können,
und zum anderen für nicht makroskopisch sichtbaren Tumor jedoch nach zwei Wochen in der
Zellkultur angewachsenen Neuroblastomzellen
Tab. 8: Überlebensdauer der Versuchstiere.
Überlebensdauer je Versuchstier in Abhängigkeit von der Behandlung. Die Nummer (x/y) setzt
sich zusammen aus der Nummer des Tierversuches x und der Nummer des Versuchstiers y.
Konjugat Ak+RA-Gemisch Retinolsäure Antikörper NaCl
Nr.
Überleben
(d)
Nr.
Überleben
(d)
Nr.
Überleben
(d)
Nr.
Überleben
(d)
Nr.
Überleben
(d)
6/1 16 6/5 22 6/17 19 6/9 20 6/13 20
6/2 22 6/6 20 6/18 20 6/10 19 6/14 18
6/3 21 6/7 15 6/19 21 6/11 16 6/15 24
6/4 22 6/8 17 6/12 19 6/16 19
7/9 28 7/5 32 7/1 30 7/17 39 7/13 28
7/10 29 7/6 29 7/2 34 7/19 40 7/14 29
7/11 34 7/7 30 7/3 33 7/20 30 7/15 34
7/12 26 7/8 36 7/4 33 7/16 26
Dank
Herrn Professor Zintl gilt mein Dank für die Vergabe des spannenden Themas
dieser Doktorarbeit.
Frau Dr. Voigt stand mir mit ihrer reichen Erfahrung jederzeit zur Seite. Ihr
danke ich ganz besonders herzlich für die engagierte Unterstützung bei dieser
Arbeit.
Bei der deutschen Forschungsgemeinschaft bedanke ich mich für die Förderung
des Projektes, in dessen Rahmen diese Arbeit erstellt wurde.
Den Mitarbeitern des hämatologischen Labors der Kinderklinik bin ich sehr
dankbar für die freundliche Arbeitsatmosphäre und die unkomplizierte Hilfe, die
ebenfalls zum Gelingen der Arbeit beitrugen.
In den Dank eingeschlossen sind Prof. Kosmehl und Dr. Berndt neben anderen
Mitarbeitern des Pathologischen Instituts unserer Universität, die mich
großzügig bei der Erstellung und Auswertung der immunhistologischen
Präparate unterstützten.
Dr. Günther, Herrn Dix und Frau Schorr vom Institut für Versuchstierkunde
danke ich sehr für die Betreuung der Versuchstiere und die praktische
Unterstützung bei den Tierversuchen.
Ein spezieller Dank gilt meinen Kollegen, deren Rücksicht und Verständnis einen
großen Anteil an der Realisierung dieser Doktorarbeit haben.
Insbesondere bedanke ich mich nicht zuletzt bei meinen Eltern für die liebevolle
und geduldige Unterstützung.
Lebenslauf
Name: Conny Schlick
Geburtsdatum: 22.05.1975
Geburtsort: Karl-Marx-Stadt
Schulbildung
09/1981 – 08/1991 POS, Chemnitz
09/1991 – 06/1993 Gymnasium, Chemnitz
29.06.1993 Abitur
Studium der Humanmedizin
10/1993 – 08/1996 Friedrich-Schiller-Universität Jena
09/1996 – 08/1997 University College London, Großbritannien
10/1997 – 09/2000 Friedrich-Schiller-Universität Jena
16.11.2000 Staatsexamen
Berufstätigkeit
01/2001 – 06/2002 Ärztin im Praktikum, Kinderklinik Jena
seit 01.07.2002 Ärztin in Weiterbildung, Kinderklinik Jena
Jena, 25. November 2002
Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist,
ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle von mir benutzten
Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben
sind,
mich folgende Personen bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie
bei der Herstellung des Manuskripts unterstützt haben: Frau Dr. Voigt aus dem
Hybridomlabor der Kinderklinik, Prof. Kosmehl und Dr. Berndt vom
Pathologischen Institut unserer Universität.
die Hilfe eines Promotionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde und
dass Dritte weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für
Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertation stehen,
dass ich die Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder
andere wissenschaftliche Prüfung eingereicht habe und
dass ich die gleiche, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere
Abhandlung nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht
habe.
Jena, 25. November 2002